硫化氢对大鼠舱室内肢体爆炸伤后肺损伤的作用

                作者：莫立稳，赖西南，甯交琳，王丽丽，郭东阳

【摘要】  目的 研究外源性硫化氢(H2S)对大鼠舱室内肢体爆炸伤后肺损伤的作用，探讨H2S相关药物在舱室战伤救治中的应用价值。方法 80mg 二硝基重氮酚(DDNP)纸制点爆源紧贴大鼠左后肢跗关节内侧于舱室内引爆致伤。大鼠随机分为单纯致伤组(E组：n=32)、致伤+硫氢化钠(NaHS)组(S组：5mg/kg NaHS，ip;n=16)和正常对照组(C组：n=8)。收集大鼠肺组织和血标本。测定大鼠胸部承受冲击波压力，测定肺组织胱硫醚?γ?裂解酶(CSE)活力和血浆H2S浓度、TNF?α、IL?6、IL?10浓度和肺含水量，观察肺组织病变化。结果 爆炸致伤后大鼠肺组织CSE活力和血浆H2S浓度显著下降(P<0.05)，TNF?α、IL?6、IL?10浓度及肺含水量较正常对照大鼠相应值显著升高(P<0.05或P<0.01)，肺出血、水肿、炎细胞浸润和肺泡结构破坏明显;而早期给予5mg/kg NaHS后伤鼠肺组织TNF?α、IL?6、IL?10浓度及肺含水量显著降低(P<0.05,vs E组)，肺出血、水肿和炎细胞浸润程度明显减轻。结论 大鼠舱室内肢体爆炸伤可引起严重的肺损伤;而早期适量给予H2S则可明显抑制肺炎性反应水平，减轻爆炸伤后肺损伤。

【关键词】  爆炸伤;肺损伤;肢体;硫化氢

　　Abstract: Objective To study the effects of hydrogen sulfide(H2S) on lung damage after limb’s explosive injury in closed space in rats,and discuss the clinical value of H2S in the therapy for explosive injury.Methods Limb’s explosive injury in closed space was adopted.Healthy male Sprague?Dawley rats (200～220g) were randomly divided into simple explosive injury group (E group,n=32),explosive injury + NaHS group (S group: 5mg/kg NaHS,ip,n=16) and control group(C group:n=8).Lung and blood samples were collected.The pressure of blast injury,CSE activity in lung homogenate，H2S concentration in plasma,TNF?α,IL?6,IL?10 concentrations in lung homogenate and lung water content were detected.Pathological change of lung was observed.Results After explosion,CSE activity in lung homogenate and H2S concentration in plasma decreased markedly(P<0.5,vs C group);TNF?α,IL?6,IL?10 concentrations in lung homogenate and lung water content increased markedly(P<0.05 or P<0.01,vs C group),and showed severe pneumorrhagia,pneumonedema,inflammatory cell infiltration and alveoli pulmonum disorganization.But in S group,TNF?α,IL?6,IL?10 concentrations and lung water content decreased significantly(P<0.05 or P<0.01,vs E group),and pneumorrhagia,pneumonedema and inflammatory cell infiltration relieved significantly.Conclusion Limb’s explosive injury in closed space could lead to severe lung damage.But injecting H2S in the early stage can relieve lung damage after explosive injury.

　　Key words:explosive injury;lung damage;limbs;hydrogen sulfide(H2S)

　　硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)是一种有臭鸡蛋气味的有毒气体，但近年发现多种哺乳动物组织细胞都有内源性H2S合成酶系的表达并具备合成内源性H2S的能力;而内源性H2S在许多生理和病理生理过程中也发挥重要的调节作用，被认为是继一氧化氮、一氧化碳之后被发现的第3种内源性气体信号分子[1，2]。随着军队机械化进程加速、各种新型装甲装备陆续列装，由于装甲战斗舱室击损而导致的舱内致伤伤员比例开始逐渐升高，舱室发生伤员的战时救治也成为了军事卫勤准备的重点之一[3]。因此，本实验采用模拟装甲舱室内大鼠爆炸伤模型研究外源性H2S对伤鼠伤后肺损伤的作用，以探索H2S相关药物在舱室内爆炸伤伤员紧急救治中的应用价值。

　　材料与方法

　　1 大鼠舱室内肢体爆炸伤模型的制作

　　健康雄性成年Sprague?Dawley大鼠(第三军医大学附属大坪野战外科研究所实验动物中心提供)。体重200～220g，实验前12小时禁食，自由饮水。3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，分离右侧股动脉行动脉插管全程监测平均动脉压(Mean artery pressure,MAP)和收集血标本。稳定30分钟后动物取坐姿固定在小尺寸模拟装甲运兵车乘员舱内C位点，左后肢前、外伸固定;80mg二硝基重氮酚(DDNP)柱状纸质点爆源(电阻值：3.7～5.7Ω，发火冲能≤8.7A.ms2)固定在左后肢胫腓骨中下段内侧皮肤处，发爆器引爆致伤;致伤后立即打开舱门、迅速抽净烟尘后取出伤鼠固定于动物台，用干纱布加压包扎伤肢，橡皮条牵引固定，每隔30分钟记录MAP 1次;其他处理按分组给予。实验结束时(致伤后3/6小时)快速放血处死动物并收集动脉血和肺组织标本，血标本离心(4000r/min，10分钟，4℃)后收集血浆，分装后-70℃冻存备用，肺组织标本分装后置于液氮中冻存备用。

　　2 实验分组

　　大鼠56只，随机分为3组：(1)正常对照组(C组)：8只，大鼠动脉插管成功后给予无菌生理盐水(2.5ml/kg，ip);(2)单纯致伤组(E组)：32只，稳定30分钟后爆炸致伤，30分钟内给予无菌生理盐水(2.5ml/kg，ip)，监测MAP至实验结束;(3)致伤+NaHS组(S组)：16只，致伤后30分钟内给予NaHS (5mg/kg，ip，Sigma)，监测MAP至实验结束。

　　3 观察指标

　　3.1 一般状况观察 观察伤鼠伤肢局部损伤情况及MAP动态变化情况。

　　3.2 肺组织匀浆TNF?α、IL?6、IL?10浓度 4℃解冻液氮中冻存的肺组织标本，称取200mg组织加入2.0ml预冷组织裂解液中，稍剪碎后匀浆机破碎离心(4000r/min，10分钟，4℃)取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白含量。按照说明书测定肺组织匀浆TNF?α、IL?6、IL?10浓度(试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司)。

　　3.3 肺含水量 肺含水量测定采用干湿比法。肺组织用吸水纸吸净表面血迹后称重，再置于90℃恒温烤箱内烘烤72小时至恒重，最后称取肺干重并肺含水量。计算公式：肺含水量(%)=(肺湿重-肺干重)÷肺湿重×100%。

　　3.4 肺组织苏木精?伊红染色(HE染色)石蜡切片的制作与观察

　　修成4mm×4mm×1.5mm的肺组织块浸入4%多聚甲醛固定液中固定48～72小时，先经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋切片(片厚：5μm)，然后脱蜡水化、苏木精染色、盐酸乙醇分色、伊红染色，再梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，最后在普通光学显微镜下观察组织病理学变化。

　　3.5 H2S浓度和胱硫醚?γ?裂解酶(cystathionine?γ?1yase，CSE)活性：方法测定血浆H2S浓度和肺组织CSE活性[4]。(1)H2S浓度：首先在试管中加入150μl 10%(W/V)醋酸锌溶液和150μl 0.01M PBS液，然后加入150μl血浆标本，振荡混匀使血浆中的S2-与醋酸锌充分反应形成硫化锌沉淀而固定下来;再依次加入100μl 20mmol/L对苯二胺盐酸盐溶液和133μl 30mmol/L三氯化铁溶液，振荡混匀后室温孵育20分钟使之充分显色。再加入300μl 10%(W/V)三氯醋酸溶液振荡混匀以沉淀蛋白。离心(6000g，5分钟，4℃)后吸取上清液，检测上清液OD670nm值。用不同浓度的硫氢化钠(sodium hydrosulfide，NaHS)绘制标准曲线，其直线回归方程为：Y(μmol/L)=1076.8X(OD670nm)，R2=0.9973。根据H2S标准曲线计算上清H2S浓度(μmol/L)。(2)CSE活性：首先将反应体系置于冰水浴中，依次在试管中加入350μl 0.01M PBS液、20μl 10mM L?半胱氨酸和20μl 2mM磷酸吡哆醛，再加入150μl肺组织匀浆，振荡混匀后封住试管口。将反应体系转移到37℃恒温水浴中准确孵育60分钟。孵育结束立即依次加入250μl 10%(W/V)乙酸锌溶液、250μl 50%(W/V)三氯乙酸溶液后振荡混匀;再依次加入133μl 20mmol/L对苯二胺盐酸盐溶液和133μl 30mmol/L三氯化铁溶液，振荡混匀后室温孵育20分钟使之充分显色;离心(6000g，5分钟，4℃)后吸取上清液，酶标仪检测上清OD670nm值。用不同浓度的NaHS绘制标准曲线，其直线回归方程为：Y(μmol/L)=1210.7 X，R2=0.9906。根据H2S标准曲线计算上清液中H2S的浓度(μmol/L)。肺组织匀浆中CSE的活性以每毫克蛋白在单位时间内生成H2S 的量来表示(nmol·min-1·mg prot-1)。

　　4 统计学处理

　　数据以(±s)形式表示，用SPSS 16.0 软件进行方差齐性检验和单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

　　结 果

　　1 爆炸参数和大鼠肢体爆炸伤后大体观察

　　所使用小尺寸模拟装甲运兵车乘员舱是根据人体与大鼠的体积比将某型装甲运兵车乘员舱等比缩小后用钢板焊接而成，尺寸为560mm×280mm×260mm(图1a、b、c)。大鼠胸部中央爆炸冲击波压力波见图2。E组有2只大鼠在致伤后4～5小时内提前死亡。伤肢远段为开放性毁损伤，胫腓骨中下段粉碎性骨折，相应神经、血管断裂，跗关节周围肌群断裂外翻，远断端肢体仅少许皮肤相连，胸腹部皮毛被熏黑(图1d)。实验过程中伤鼠MAP逐渐下降，但差异无统计学意义(图3)。

　　2 大鼠肺脏TNF?α、IL?6、IL?10浓度变化

　　E组大鼠致伤后肺组织匀浆TNF?α、IL?6、IL?10浓度显著升高(P<0.05或P<0.01);而S组早期给予5mg/kg NaHS后肺组织匀浆TNF?α、IL?6、IL?10则显著降低(P<0.05或P<0.01，vs E)。提示早期给予适量H2S可显著降低大鼠爆炸伤后肺组织炎症因子表达水平，减轻肺组织炎性损伤(图4)。

　　4 大鼠肺含水量变化

　　E组大鼠致伤后肺含水量较正常对照大鼠(C组)显著升高(P<0.01);S组大鼠早期给予5mg/kg NaHS后伤鼠肺含水量则显著降低(P<0.05 vs E)。提示早期适量H2S可显著减轻大鼠爆炸伤后肺水肿程度(图5)。

　　5 大鼠肺组织病变化

　　C组大鼠肺泡形态正常，肺泡壁完整，无明显的出血、炎细胞浸润和液体渗出。E组大鼠遭受舱室内肢体爆炸伤后0.5小时内即出现肺原发性冲击伤改变，主要表现为肺出血、肺间隔断裂，肺泡萎陷等;随着时间的延长，肺充血、水肿和炎细胞浸润逐渐加重，肺间隔极度增厚，肺泡结构破坏严重。而S组大鼠早期给予5mg/kg NaHS后伤鼠肺组织病变较E组明显减轻。提示早期给予适量H2S可显著减轻大鼠舱室内肢体爆炸伤后肺损伤(图6)。

　　6 大鼠CSE活性和H2S浓度变化

　　大鼠致伤后1小时血浆H2S浓度和肺CSE活性开始显著下降(P<0.05或P<0.01，vs 0小时;表1)，且其表达水平与伤鼠肺含水量等呈负相关(CSE与肺含水量之间：rp= -0.970，P<0.01;H2S与肺含水量之间：rp= -0.918，P<0.05)。提示肺CSE/H2S体系参与了大鼠舱室内肢体爆炸伤后肺损伤过程的调节，并在此过程中发挥肺保护作用(表1)。表1 大鼠CSE活性和H2S浓度变化

　　讨 论

　　战斗舱室主要是指具有装甲防护能力的坦克、装甲车辆，也包括相对密闭的坚固工事等，是高技术条件下局部战争中的主要作战单元。目前，针对战斗舱室的反装甲攻坚武器主要以高动能穿甲弹或聚能破甲弹金属射流击穿战斗舱室以杀伤舱内人员[5]。随着我军各种新型装甲装备陆续列装，在军事斗争中舱室内战位伤发生率将逐渐增多。因此，开展陆军战斗舱室军事作业效能保障研究以明确舱室战位伤特点及损伤机制、提出早期诊治预案对改善军事作业效能、做好军事卫勤准备具有重要意义。本实验采用模拟装甲舱室内大鼠爆炸伤模型研究外源性H2S对伤鼠舱室内爆炸伤后肺损伤的作用，以探讨内源性H2S相关药物在战斗舱室内爆炸伤紧急救治中的临床应用价值。

　　H2S是一种具有强烈臭鸡蛋气味的有毒大气污染物。近年发现多种哺乳动物组织细胞都有内源性H2S合成酶系的表达并具备合成内源性H2S能力。内源性H2S主要由半胱氨酸在胱硫醚?β?合成酶(cystathionine?β?synthase，CBS)、胱硫醚?γ?裂解酶(cystathionine?γ?yase，CSE) 和半胱氨酸转移酶等5'-磷酸吡哆醛依赖性酶系的催化作用下生成，并主要以气态H2S和NaHS两种形式存在[2]。内源性H2S作为重要的创伤炎症调节因子，在创伤炎症过程发挥重要的作用[3，6]。本实验采用5mg/kg NaHS腹腔注射给药方式，给药剂量远低于目前公认的大鼠NaHS急性毒性半数致死剂量(LD50: 30mg/kg,ip)，预实验亦证实单独给予腹腔注射给予5mg/kg NaHS对大鼠无明显毒副作用。在预试验中，我们发现大鼠舱室内肢体爆炸伤后1小时开始出现轻度肺损伤，伤后3小时则出现较为明显的肺组织病理损伤，故NaHS干预组选择爆炸致伤后3小时及6小时为观察时相点。

　　本实验发现大鼠遭受舱室内肢体爆炸伤后肺CSE/H2S体系表达显著下调，肺组织TNF?α、IL?6、IL?10浓度和肺含水量显著升高，肺出血、水肿、炎细胞浸润和肺泡结构破坏明显;而早期给予5mg/kg NaHS则可显著降低伤鼠肺TNF?α、IL?6、IL?10浓度和肺含水量，肺出血、水肿、炎细胞浸润程度亦明显减轻。结果提示大鼠舱室内肢体爆炸伤可引起严重的肺组织炎性损伤，加之舱室内冲击波叠加效应所导致的原发肺损伤[7]，它们可通过单独和(或)协同作用维持并加重肺损伤;而早期适量外源性H2S则可显著减轻爆炸伤后肺损伤程度。目前关于H2S调节脏器损伤的机制尚不清楚。有研究提示H2S可能通过血红素加氧酶?1/一氧化碳(HO?1/CO)、核因子κB(NF?κB)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、KATP/Cl-通道等途径[8-11]调节组织细胞炎症反应和过氧化反应水平。

　　本实验以模拟装甲战斗舱室内大鼠爆炸伤模型为研究平台，初步探讨了外源性H2S对伤鼠舱室内爆炸伤后肺损伤的作用，为舱室内爆炸伤伤员的紧急救治提供了初步实验依据和一条新思路。

【】
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