实验性胸腹撞击伤后血浆TNF?α、IL?1基因水平的变化特点及意义
【摘要】 目的 探讨胸腹撞击伤前后血浆肿瘤坏死因子?α(TNF?α)、白细胞介素?1(IL?1)的DNA和RNA水平动态变化特点及临床意义。方法 随机选取新西兰兔12只，采用BIM?Ⅳ型生物撞击机撞击右侧胸壁及剑突部致伤。运用聚合酶链反应(PCR)和反转录多聚酶链反应(RT?PCR)技术监测胸腹撞击伤前后不同时相点血浆中TNF?α和IL?1的DNA和RNA的变化水平。结果 胸腹撞击伤后动物血浆中TNF?α、IL?1的DNA和RNA水平的表达在30分钟内急剧升高，与伤前比较差异非常显著(P﹤0.01)，直至8小时后或动物死亡时仍高于伤前水平(P﹤0.05)。结论 胸腹撞击伤后血浆TNF?α、IL?1的DNA和RNA的变化特点是变化发生早，灵敏度高、特异性强，检测方法简单、稳定性好。监测其动态变化对于了解和掌握胸腹伤的伤情预后具有重要的临床意义。
【关键词】 撞击伤;胸部损伤;腹部损伤;DNA;RNA
Abstract： Objective To study the characteristics and clinical significance about the DNA and RNA level of TNF?α and IL?1 before and after thoraco?abdominal impact injury.Methods A thoraco?abdominal impact injury model was established and the DNA and RNA level of TNF?α and IL?1 before and after thoraco?abdominal impact injury were measured by the PCR and RT?PCR technology.Results The DNA and RNA levels increased within 30 minutes after injury(P﹤0.01).The increased DNA and RNA level decreased 8 hours after impact injury.But it was still higher than the normal level before death(P﹤0.05).Conclusion The change of the DNA and RNA level of TNF?α and IL?1 after thoraco?abdominal impact injury has characteristics,such as quickliness,high sensitivity,high specificity,simple measurement,good steadiness.Monitoring its changes is helpful for predicting the prognosis of thoraco?abdominal impact injury,which has some clinical reference value.
Key words：impact injury;thoracic injury;abdominal injury;DNA;RNA
胸腹撞击伤在平时多见于事故、高处坠落及工矿事故等，其往往损伤脏器多，伤情复杂，常继发多器官功能障碍综合征(MODS)，对机体生理功能影响大，是严重创伤的主要死亡原因。本研究旨在通过建立胸腹伤动物模型的基础上，对伤后血浆中TNF?α和IL?1的DNA和RNA水平变化进行动态监测，研究其变化和特点，为临床在胸腹伤的救治中防治MODS提供有价值的实验依据。
材料与方法
1 动物模型制备
选择健康成年新西兰兔12只(第三军医大学大坪实验动物中心提供)，雌雄不限，兔龄8～10个月，体重2.5～3.0kg，将其随机编为1～12号。用3%戊巴比妥钠(1ml/kg)耳缘静脉注射麻醉后取仰卧位，将实验动物置于BIM?Ⅳ型生物撞击机下(第三军医大学大坪医院全军战创伤中心研制)，采用2个重 362.8g，直径4.4cm的钢球自撞击机钢管1m高处以自由下落方式对动物右侧胸壁及上腹部剑突处撞击致伤[1]。撞击过程的动力学参数如下：
撞击动能E= mgh≈7.111J g= 9.8m/s2
撞击速度V=2gh≈4.427m/s
撞击动量MV=0.716×V≈3.212kg.m/s
自由落体运动时间T=2×19.8≈0.452s
2 指标监测
2.1 用RM6240 型四道生理记录仪监测呼吸、心率、血压等生命体征。
2.2 血浆DNA和RNA的反转录多聚酶链反应(RT?PCR)半定量监测：按照试剂盒说明进行，肿瘤坏死因子?α(TNF?α)的引物序列:上游5’GCTGAGCCAGCGTGCGAACG 3’、下游5’ CAGGTACTCAGGCTGGTTGA 3’,扩增出340bp的cDNA片段;白细胞介素?1(IL?1)的引物序列:上游5’ GGATGACGGCCTGAGAACTT 3’、下游5’ TCACGCAGGACAGGTACAGA 3’，扩增出305bp的cDNA片段。退火温度为53℃;内参照选用β?actin寡核苷酸引物序列：上游5’ ACGATGCTCCAAGAGCTGTT 3’、下游5’ TCAGGCAGCTCATAGCTCTT 3’，扩增出660bp的cDNA片段，退火温度为51℃。基因及内参照β?actin引物序列购自重庆升博生物科技公司。取同一样品总RNA2μg，按试剂盒说明进行，产物的检测在琼脂糖凝胶上电泳,凝胶成像系统拍摄。
3 损伤评估
按实验要求对伤后 12 只实验动物采取活杀或死亡后进行大体解剖，详细检查和记录肝脏、肺、心损伤的类型、特点、严重程度以及有无其他脏器的合并伤。对肝、肺脏器损伤按美国创伤外会1994年修订的(AAST)[2]分级标准和AIS?90评分[3]进行分级和评分。
4 特异性实验
RNA具有组织特异性，以12例实验兔伤前和伤后外周血标本为模板进行扩增反应后相比较，差异明显(P﹤0.01)说明有特异性。
5 敏感度实验
血液中RNA含量极少，如果能在伤后重复检出其表达发生变化, 亦能反映该方法的灵敏度。
6 统计学处理
所得结果用医学图像分析系统测定其灰度值，用SPSS10.0对数据进行处理，多组间进行单因素的方差分析，以P<0.05为差异有显著性，所有计量资料均以均数±标准差(±s)表示。
结 果
1 实验动物伤后生命体征变化(表1)
所有动物撞击后出现呼吸暂停，数秒钟后呼吸运动恢复,动物表现烦躁、呼吸频率急剧加快，最高平均达90次/min,并出现呼吸窘迫及呼吸反常运动。随着伤后时间的延长，动物呼吸逐渐减慢，伤后8小时平均为57次/min，但仍未恢复至伤前的水平(37次/min)。伤后心率加快至平均149次/min，随后逐渐降低，至8小时后低于正常直至心脏停搏死亡。血压在伤后低于伤前，并逐渐降低。实验动物伤后肝脏破裂死亡：即刻1例(8.3%);1小时1例(8.3%);2小时1例(8.3%);3小时1例(8.3%);5小时1例(8.3%);8～12小时5例(41.7%);>12小时2例(16.7%) 。死亡原因为失血性休克及MODS。
2 动物解剖、 伤情特点及分级
2.1 肺损伤 肺损伤发生率达100%(12/12)。主要表现为肺组织呈点状、片状出血及弥漫性充血、水肿的特点。其中点状、片状出血3例(25%)，弥漫性充血、水肿9 例(75%)。本组无肺破裂、肺大血管损伤的病例。肺损伤部位：右肺损伤2例(16.7%)，左肺损伤2例(16.7%)，双肺同时损伤8例(66.7%)。按 AAST损伤分级划分：Ⅱ级4例(33.3%)，AIS评分3分;Ⅲ级8例(66.7%)，AIS评分3～4分;无Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ级的病例。
2.2 肝损伤 肝脏损伤的发生率达100%(12/12)。损伤类型主要有肝包膜下出血、肝实质裂伤及星芒状裂伤。肝裂伤伤口长0.5～3.5cm,深0.2～1.5cm。腹腔内积血量50～150ml。按 AAST 损伤分级标准进行分级，结果:Ⅱ级 10 例(83.3%)，AIS评分2分;Ⅲ级2例(16.7%)，AIS评分3分。无I、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ级的病例。
2.3 心脏损伤 心脏损伤的发生率为 33.3%(4/12)，肉眼所见主要为心包出血1例(8.3%);左心室心肌破裂1例(8.3%);心耳瘀血1例(8.3%);左右心室腔内膜点状或点片状出血1例(8.3%)。
3 血浆游离IL?1的DNA和RNA的变化(表2及图1和图2)
实验动物血浆中IL?1的DNA和RNA在撞击伤后30分钟内就表达到最高(分别达3.56±0.67,4.23±0.98)，与伤前组相比有显著差异(P﹤0.01),此后略有下降,仍高于伤前(P﹤0.05)。
4 血浆游离TNF?α的DNA和RNA的变化(表3及图3和图4)
实验动物血浆中TNF?α的DNA和RNA在撞击伤后30分钟内就表达到最高(分别达0.99±0.07,1.43±0.19)，与伤前组相比有显著差异(P﹤0.01),此后略有下降,仍高于伤前(P﹤0.05)。
5 伤情分级与基因表达峰值(表4)
胸腹撞击伤后血浆DNA和RNA的表达在30分钟达到峰值，且与损伤分级成正比，损伤越严重，分级越高，高峰的表达值越高。表1 实验动物各时相点生命体征变化注：心脏破裂1例标本只取伤前与伤后比较表2 实验动物各时相点血浆IL-1的DNA和RNA含量变化 注：心脏破裂1例标本只取伤前与伤后比较表3 实验动物各时相点血浆的TNF?α的DNA和RNA含量变化注：心脏破裂1例标本只取伤前与伤后比较表4 伤情与伤后基因峰值表达
讨 论
胸腹撞击伤往往是多个器官的损伤，伤情重，病理生理过程复杂。特别是肝损伤造成的失血性休克、急性肺损伤造成的低氧血症及心脏损伤造成的心功能不全等都可引起一系列继发性损害，并常伴发MODS，死亡率高达 50%以上[4]。而能够早期的预测病情，积极合理救治，阻断病情恶化向MODS转化，将大大提高患者的生存率，所以能够找到一个灵敏和特异的预测伤后MODS发生的指标是亟待解决的重点。
本研究建立的胸腹撞击伤动物模型具有如下特点：(1)撞击设备操作简便、物理参数容易控制、撞击部位准确、可重复性好和较真实地模拟胸腹损伤;(2)实验动物肝、肺、心脏损伤的病理、类型、伤情与临床较为接近;(3)肝、肺、心脏的损伤AAST分级集中在Ⅱ～Ⅲ级，AIS评分2～4分;(4)可利用致伤模型进行力学因素分析及多项实验指标的检测，从而为胸腹撞击伤的防治研究提供了较理想的实验模型。
目前，临床上除常用的脏器功能监测指标外，多采用一些与脏器损害有关的标记分子来反映伤情变化[5，6]，如：炎性细胞因子、核因子?κB等。但这些指标的主要不足之处在于它们的灵敏度、特异性不够高，不能准确反映特定细胞、组织或器官的早期损害及其程度[7]。相比之下，血浆DNA和RNA浓度较简便易测，且RNA具有组织特异。DNA和RNA是发生在基因水平上的改变，受其他因素影响小，具有良好的稳定性。所以可以用血浆DNA和RNA的变化来反映细胞、器官损伤程度，特别是可用于反映特定细胞、器官的损伤程度。国外学者通过实时定量PCR发现创伤后几个小时内游离DNA浓度就会增高[8]，且与损伤严重程度有关。目前国外研究[9]更多的是通过RT-PCR技术测定脓毒症动物模型全血或者器官中特定基因(如Mcl?1、Bid、Bcl?2、c?fos、Egr?1、HSF?1等)的mRNA表达水平的变化来反映患者器官损伤程度。研究表明[10]，脓毒症动物模型的全血或者器官中特定基因的mRNA水平几个小时内就发生了明显的改变，与损伤严重程度有关。本研究结果显示，12例实验动物血浆DNA和RNA在撞击伤后变化非常明显，伤后30分钟与伤前相比差异非常明显(P<0.01)，说明具有高度的特异性。血浆游离DNA的来源不太清楚，可能与凋亡、坏死细胞释放出的胞内DNA入血有关[11]。依同样的原理，我们推测细胞、组织、器官损害后在释放出相应的DNA的同时，同样也释放出RNA。
许多人把TNF?α和IL?1作为创伤后伤情重要指标[12]。TNF?α是创伤后非常具有影响力的一个细胞因子[13]，它一方面直接损伤血管内皮细胞，增强血管通透性;另一方面，也诱导其他炎症因子(如IL?1、IL?6等)的产生或者浓度的改变。国外研究表明，在脓毒症动物模型研究中，TNF?α是最早发生变化的指标，一般在注射内毒素后2小时达峰值。而IL?1(特别是IL?1β)亦是较早发生改变的指标，在第3小时达到高峰[14]。众所周知，蛋白水平的改变来源于核酸水平的改变，即是说，首先是由于DNA转录水平的调整，导致mRNA水平的改变，进一步导致翻译水平的改变，而翻译水平改变的直接结果就是蛋白水平的改变。因此，比细胞因子TNF?α、IL?1β水平改变出现更早的是它们的DNA和mRNA水平的改变。本研究结果显示，12例实验动物血浆TNF?α、IL?1的DNA和RNA在撞击伤后伤后30分钟内就迅速达到峰值，此后虽然逐渐下降,但直至死亡仍显著高于伤前(P﹤0.05)。说明机体在基因水平上对损伤非常敏感，能够迅速发生改变来控制伤情，并在反映伤情方面与蛋白水平一致，但比蛋白水平变化早，具有更加高的灵敏度。并且伤后峰值与伤情分级成正比，能够准确反映伤情轻重，它的持续升高将预示伤情进一步加重或发生MODS。
综上所述，胸腹撞击伤后血浆TNF?α、IL?1的DNA和RNA的变化特点是变化发生早，灵敏度高、特异性强，检测方法简单、稳定性好。监测其变化对于了解和掌握胸腹伤的伤情预后具有重要的参考意义。
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