Experimental Research体内镁合金的降解和成骨反应的动物实验探索

              作者：于国宁，闻久全，潘峰，蒋阅，张二林，徐丽萍，范广宇 

【摘要】  ［目的］研究动物股骨干内植入镁合金后，在镁合金降解过程中，金属－骨界面的骨质反应机制。［方法］在SD大鼠的股骨干中横向植入镁合金金属棒，术后抗炎，自由活动，9周后处死取材，分别在金相显微镜下观察金属－骨界面的宏观改变，扫描电镜（SEM）下观察金属－骨界面的微观改变，应用能谱分析(EDS)技术确定元素组成；并且将骨棒做脱钙切片染色，光镜下观察金属－骨界面的组织学变化。［结果］随着股骨内镁合金的降解，周围骨表面和镁合金降解表面同时发生骨质反应，在金属－骨界面形成紧密相邻的金属层、降解层、新生骨层3个层次，新生骨质表面未见炎性细胞浸润，可见少量间断性纤维结缔组织。［结论］ 金属－骨界面的骨质反应完全符合正常骨质愈合过程，新生骨质与正常骨质的形态结构完全一致；因此可以推断镁合金具有良好的降解性、成骨性及组织相容性，其降解过程与新骨成骨过程具有良好的同步性。

【关键词】  镁合金； 降解； 成骨反应

    Abstract：［Objective］To study the mechanism of magnesium alloy degradation and bone formation at the bone?implant interface after implanting a magnesium alloy into rat femur. ［Method］SD rats femur were filled with magnesium alloy stick. Nine weeks later, animals were killed and femur were retrieved. Systematic investigations on the surface morphology, composition, structure of bone?implant were performed by means of metallurgical microscope, scanning electron microscopy (SEM), and energy dispersive spectrum (EDS). Decalcified sections were prepared, and histologic examination was carried out. ［Result］The bone response happened both on the surface of surrounding bone and the surface of magnesium alloy degradation layer while magnesium alloy degradating in rat femur. It was formed three layers at the interface of bone?implant: the metal layer, the degradation layer, and the new bone layer. Discontinuity connective tissue could be seen on the new bone layer but no inflammatory cells were found.［Conclusion］The new bone response at the interface of bone?implant is consistent with normal bone tissue. Magnesium alloys have good characters of degradation ability, osteogenesis ability, and histocompatibility. And the rate of degradation is corresponding to the rate of new bone formation.

    Key words：magnesium alloy;  degradation;  new bone formation

    镁合金是近年来矫形外中金属内置物的研究热点，因其比其他金属材料有更优越的理化特性，因此备受关注［1］。镁合金具有可降解性，理论上可以使需使用金属内置物的患者免去2次手术，大大减轻患者的精神负担和负担，所以，本研究试图对其降解性及成骨性做一初步探索。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及材料

    SD大鼠5只，雌雄不限，体重300～350 g；镁合金棒（中科院金属研究所），长3 mm，直径1.5 mm；电钻，钻头直径1.5 mm；常规手术器械。

    1.2  手术过程

    将动物用1％戊巴比妥（40～50 mg/kg）腹腔注射麻醉，侧卧位，在左股骨干上1/3外侧，用电钻垂直于骨干方向钻孔，对穿，将镁棒植入，冲洗清洁伤口，缝合。

    1.3  术后处理及取材

    动物从麻醉苏醒后自由活动，自由饮食，肌注青霉素40万单位，日1次，连续5 d。术后9周拉颈处死，取出股骨干，2.5％戊二醛，4℃过夜固定。

    1.4  显微镜下观察

    将标本放在金相显微镜及扫描电镜（日本岛津SSX-550）下观察并进行能量分布光谱探针（EDS）测试。

    1.5  脱钙切片制备及观察

    首先配制15％EDTA脱钙液，然后将固定后标本放入脱钙液中，5 d换液1次，共20 d，使镁合金完全降解并脱钙，最后，包埋，切片，HE染色，在光学显微镜下观察。

    2  结  果

    2.1  动物一般情况

    所有动物完成实验，无意外死亡。术后均可自由行走。1只大鼠切口感染，股骨干感染断裂，畸形愈合，其余正常。

    2.2  金相显微镜

    镜下见镁合金边缘不规则，周围形成较薄的降解层，被外周的较厚的结晶状骨质紧密包裹，新生骨质生成明显，且与周围原骨质紧密连接(图1)。

    2.3  扫描电镜

    镜下见金属－组织界面分为明显3个层次，由内向外依次是金属层、降解层、新骨层。可见有一几乎连续的纤维结缔组织层形成于降解层与新生骨层之间(图2)。应用能量分布光谱探针（EDS）可以测定各个层次的元素组成成分，金属层主要由镁(Mg)元素构成；降解层主要是由碳(C)、氧(O)构成的结缔组织和由钙(Ca)、磷(P)、镁（Mg）构成的降解碎块；新骨层主要由钙(Ca)、磷(P)、碳(C)、氧(O)构成，完全符合相应的理论组成(图3)。

    2.4  组织学观察

    镜下见在镁合金金属棒周围有完整的螺旋状新骨形成，可见明显骨隐窝及新生骨小梁，排列整齐且致密；在镁合金降解区与新生骨之间有一层淡粉色的过渡带，在新骨中及新骨/植入物交界面均未见炎性细胞(图4)。

    图1  股骨内植入镁合金9周后，镁合金表面凹凸不平，髓腔内合金周围可见明显的结晶状新生骨质生成，并与周围皮质骨紧密相连（20×）  图2  镁合金与新生骨界面明显分为3个层次，金属层(1)，降解层(2)，新骨层(3)（700x）  图3  EDS探测镁合金与新生骨界面三层次的元素组成，显示金属层主要由镁(Mg)元素构成；降解层主要是由碳(C)，氧(O)构成的结缔组织和由钙(Ca),磷(P)，镁（Mg）构成的降解碎块；新骨层主要由钙(Ca),磷(P)，碳(C)，氧(O)构成  图4  HE染色，股骨内植入镁合金9周后，髓腔内可见新生骨质形成，与周围皮质紧密相连，且结构一致。新骨内侧可见粉红色过渡带，考虑为纤维结缔组织的胶原成分，局部骨组织未见炎性细胞浸润，（a)100×   （b) 400×

    3  讨  论

    本实验主要初步探索镁合金在动物体内的降解特性以及降解过程中的成骨特性。结果显示，在镁合金植入动物体内9周后，确实可以降解，其降解过程稳步由外周向中心过渡。这说明，镁合金的降解速度不仅取决于镁合金的成分，还更依赖于合金表面所接触的液态环境，它的成分及pH值可以直接影响合金的降解速度，这是一个动态的电化学过程。通过控制镁合金与周围液态环境的接触面积或者对镁合金的表面进行修饰，可以控制镁合金的降解速度，因此从图2、3可以推测，在镁合金开始降解时，逐渐在表面形成了一层钙、磷的保护层，这有助于降低镁合金的降解速度，为新骨的形成赢得时间。

    　　另一方面，从扫描电镜和组织学结果来看，镁合金降解过程，并未影响到骨折的正常愈合过程，新骨形成过程与正常骨重建过程吻合，在镜下看到的骨形成单位，与Parfitt［2］所描述的骨重建单位的形态学是一致的，新生的骨小梁结构与原骨质的骨小梁结构基本相同。在镁合金植入动物体后，结缔组织迅速在骨/植入物交界处形成并逐渐机化，消除炎症并临时代替骨组织保持骨折的稳定型，进而分泌胶原诱导成骨细胞聚集粘附分泌基质，逐渐矿化形成新骨。这一过程在合金降解表面不断重复，最终使降解层逐渐被新骨层取代。这就可以解释图2、4中结缔组织出现的意义。随着成骨细胞的作用，新骨不断形成。

    作为一种潜在的骨科内置物材料，其中很重要的一点在于，在骨折未完全愈合之前，内置物要起到充足的支撑作用。而对于镁合金来说，由于其特殊的可降解性，则要求其降解速度必须与新骨形成速度匹配。如果镁合金在体内降解过快，则会引起内置物的松动，脱落，导致骨折处不稳定及再损伤；而且由于大量镁离子的释放，会引起体内的离子紊乱等不良后果。在本实验中，镁合金在降解过程中，降解空间完全由骨小梁充填，从图1可以看到，新生骨质与镁合金和原皮质骨紧密相连，这说明镁合金的降解速度与新骨形成速度基本同步，完全匹配，从而可以保证在骨折完全愈合过程中一直起到足够的支撑作用。

    与目前应用及研究较为广泛的钛合金［3］相比,镁合金具有很好的3个优势：

    （1）可降解性。镁金属自身可以较快的降解，这在理论上可以免除大部分患者需要取出内置物的二次手术，也节省大量的人力物力，如果纯镁降解速度很快，会引起一系列问题，如体内大量镁离子蓄积，新骨未及时充填，镁棒松动脱出，等等，因此，要在镁金属中加入一定的其他元素以改善其理化性状；（2）可吸收性。加入的元素如锰，锌等，与镁元素一样，都是人体内所必须的元素，可以通过正常的代谢途径排出体外［4］，不会对人体造成不良影响。从病理图片可以看到，在降解区及新骨中均未见炎性细胞，说明了镁合金良好的组织相容性；（3）良好的成骨性。有实验表明，镁离子有促进钙磷及胶原蛋白沉积的作用［5］，而钙磷及胶原都是骨基质的主要成分，因此，镁合金在降解过程中释放出的镁离子，能够促进成骨的反应。所以，镁合金有良好的成骨性。

    对于在降解区与新生骨小梁之间的粉色过渡带，考虑是结缔组织中的胶原成分，是成骨细胞趋化及固定的铺垫，是新生骨与降解层的桥梁［6］。由于它的引导，降解层逐渐被新骨层取代，这需要进一步验证。同时，对于镁合金降解过程中对生物体的其他理化影响，也需要进一步研究。

    4  结  论

    从本实验看，镁合金确实具有稳定的可降解性，明确的成骨性及良好的组织相容性；在镁合金的降解过程中，骨折愈合过程中的成骨反应未受不良影响，基本符合正常的成骨过程，同时，镁合金的降解速度与新骨形成速度基本匹配，因此，在骨折愈合过程中，可以始终起到稳定的支撑作用。

【】
  ［1］ Mark P， Staiger, Alexis M. Magnesium and its alloys as orthopedic biomaterials: a ［J］. Biomaterials, 2006, 27: 1728-1734.

［2］ Parfitt AM. Osteonal and hemi-osteonal remodeling: the spatial and temporal framework for signal traffic in adult human bone［J］. J Cell Biochem, 1994,3: 273-286.

［3］ 王锐英，张其亮，傅德皓，等.钛合金支撑架植入股骨头缺血性坏死的动物实验研究［J］.矫形外科杂志，2007，7：538－540.

［4］ Lothar T. Labor and diagnose［M］.Frankfurt:TH?Books, 2000.

［5］ Zreiqat H, Howlett CR. Mechanisms of magnesium?stimulated adhesion of osteoblastic cells to commonly used orthopaedic implants［J］. J Biomed Mater Res, 2002, 62: 175-184.

［6］ 苗 军，王继芳，赵 斌，等.磷酸钙水泥降解成骨机制的研究［J］.中国矫形外科杂志，2005，5：365－367.