非创伤性股骨头缺血性坏死发病机制的分子生物学研究进展

                   作者：张雷，杨国敬，郑进佑，王珺 

【关键词】  非创伤性 股骨头缺血性坏死 发病机制 分子生物学

股骨头缺血性坏死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)是骨科临床较常见的进展性疾病。大体可以分为创伤性和非创伤性ONFH，病因复杂，病程缓慢，困难，致残率高，是医学领域尚未攻克的难题。近些年来，非创伤性ONFH的发病率呈上升趋势，引起广泛的关注。

    创伤性ONFH的发病原因比较明确，一般认为外伤导致股骨头营养血管血流的直接中断从而继发骨细胞的坏死；而非创伤性ONFH的发病是多因素作用下的复杂病理过程，发病机制研究由于缺乏理想的动物模型和纵向比较研究，虽取得了很多进展，但仍处百家争鸣的现状。利用分子生物学技术以明确非创伤性ONFH相关的发病机制，可能开拓本病研究的新方向。

    1  非创伤性ONFH与凋亡

    传统观点认为ONFH在细胞水平上的病理变化主要是骨组织的“坏死”。但学者们发现在ONFH的病理切片上却只表现为骨细胞消失，骨陷窝空虚，并没有明显的炎症细胞浸润。随着“细胞凋亡”的发现，人们在对“坏死”和“凋亡”两种细胞死亡方式的出现时间对比后，开始对ONFH的概念提出质疑，并就ONFH后早期的病理过程进行重新思考。Sato等［1］经观察大鼠创伤后ONFH的病理变化，发现确实有细胞凋亡的参与。在创伤后仅3 h就检测出凋亡相关基因(ORPl50和HO1)的mRNA表达；而组织学变化则开始于12 h以后，表现为可见的凋亡小体形成，整个凋亡过程在24 h左右达到高峰，而在伤后4 d逐渐减少和消失。Sato指出ONFH的命名有误：一方面细胞死亡确实遵循了凋亡的途径，没有证据表明细胞发生了坏死；另一方面，没有出现组织坏死中常见的细胞肿胀和炎症细胞浸润现象。

    在激素引起的非创伤性ONFH的动物试验研究中，有人也比较明确地验证了凋亡和非创伤性ONFH的关系，并认为在激素性骨坏死的早期，细胞死亡主要是通过凋亡的方式进行。Kabata等［2］对早期激素性ONFH的兔模型利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediate ddUTP nick end labeling，TUNEL)也证实了细胞凋亡的存在。Weinstein等［3］首次对ONFH患者术后的股骨头骨组织应用TUNEL法进行了凋亡细胞的检测，发现在激素性ONFH的软骨下骨骨折周围(新月体处)有大量的骨细胞和成骨细胞凋亡，酒精性坏死的股骨头中也有少量凋亡细胞。此外，还有学者在基因和信号传导通路水平对激素诱导的细胞凋亡进行深入研究。Tsuji等［4］运用cDNA阵列和RT-PCR等技术利用体外培养的大鼠成骨细胞株研究激素对成骨细胞凋亡的作用，发现大剂量的激素在组织缺氧状态下可导致凋亡调节基因(p53、Bax、Bcl-2和MDM2)明显的改变从而诱导细胞凋亡。

    迄今为止关于ONFH细胞凋亡的研究大都基于动物实验，人体骨组织的细胞凋亡研究将是非创伤性ONFH发病机制未来研究的重点方向。

    2  非创伤性0NFH与血管内皮细胞

    大量的研究资料表明，血管因素所致的缺血缺氧在非创伤性股骨头缺血坏死的发病中起重要作用。常见的内皮源性心血管活性物质包括内皮素-1(ET-1)和血管内皮舒张因子(NO)。ET-1是人体内最强的收缩血管物质，其对微血管的收缩作用远远强于大血管。早在1998年，B?rcs?k等［5］就发现激素可以增加内皮素受体A(EDAR)的mRNA表达水平，同时血浆ET-1水平也明显增高。Drescher等［6］在对猪骺外侧动脉的研究中发现激素治疗组ET-1引起的血管收缩强度明显高于对照组。他们认为ET-1含量升高，可以使血管强烈收缩，在股骨头内形成高灌低排、髓内血液淤滞、骨内高压及血液高凝，易于形成血栓。尤其是微血管收缩直接影响股骨头微循环和物质代谢；同时ET-1还促使血管平滑肌、内膜增生肥厚，导致管腔狭窄，更易栓塞。上述病理改变将严重影响股骨头血液循环和营养供应，最终导致股骨头缺血坏死。

    NO是近年来发现的由血管内皮细胞分泌的重要血管活性物质，具有舒张血管平滑肌、抗血小板粘附聚集等作用。1990年DiRosa等［7］发现激素可以通过抑制一氧化氮合酶(NOS)的活性而使NO合成减少，但未阐明非创伤性ONFH与NO之间的确切关系。国内外不少学者均发现激素性和酒精性ONFH病人血浆中的NO含量明显减少［8、9］。但是，Calder等［10］的一项新型研究却发现了相反的结果：他发现在坏死股骨头局部骨组织中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达显著增加，局部NO含量增加，同时伴随凋亡细胞的增多。实验结果说明eNOS的表达增加反映了局部骨组织重塑形的活跃；而成骨细胞和骨细胞中iNOS高表达导致坏死区域NO产物合成增加，局部高NO的毒性作用通过诱导细胞凋亡并激活相应的炎症介质最终导致进行性的骨质破坏。尽管Calder的研究很好地解释了骨坏死区域自股骨头向股骨近端的原因，但目前血浆与骨组织NO水平存在差异的原因尚未明确，还有待进一步的研究。

    血管内皮生长因子(VEGF)能特异地作用于血管内皮细胞，促进其增殖和血管生成，在人体生理及病理血管生成中发挥关键性作用。最近的不少研究发现ONFH的病变过程中存在VEGF的参与。Suzuki［11］已发现了VEGF可以促进ONFH局部区域的新生血管形成。但是不少学者在VEGF的实验研究上面却发现了不同的结果。国内赵宏斌等［12］发现在ONFH动物模型股骨头内的VEGF基因表达受到抑制，血管再生极慢使骨修复能力明显下降，新骨形成也明显减慢。而Radke等［13］应用免疫组化技术却在从ONFH患者取出的骨组织中不仅观察到VEGF的高表达，同时也发现了其他促血管生成物质如血管诱导生成因子61(CYR61)和结缔组织生长因子(CTGF)表达增高，他认为股骨头缺血缺氧后可导致骨组织血管化再生增加，骨修复能力增强。因此，ONFH不同时期是否存在VEGF基因表达的差异仍有待探索。

    3  非创伤性ONFH的基因组学研究

    早期对非创伤性ONFH的基因学研究都是建立在血管内凝血机制的实验基础之上。有关于Perthes病的研究结果差异较大。Arruda等［14］认为Perthes病与凝血因子VLeiden突变有关，但与凝血酶原20210基因突变和甲基四氢叶酸还原酶基因C677T无关。Lopez-Franco的研究发现Perthes病与凝血因子VLeiden突变、凝血酶原20210基因突变和甲基四氢叶酸还原酶基因C677T均无显著相关［15］。另外Dilley等［16］新发现了纤维蛋白原基因pG-455-A多态性是Perthes病的一个重要危险因素。基于对Perthes病的研究结果，Ekmekci等［17］在成人同种异体肾移植术后ONFH病人发现其与凝血因子VLeiden突变和凝血酶原20210基因突变存在明显相关；Biorkman等［18］进一步研究发现成人特发性ONFH病人发生凝血因子VLeiden突变和凝血酶原20210基因突变的频率远高于激素性和酒精性ONFH。而Celik等［19］的另一项研究却未能发现同种异体肾移植术后成人ONFH与凝血因子VLeiden突变、凝血酶原20210基因突变和甲基四氢叶酸还原酶基因C677T的相关性。

    近年ONFH其他有关基因组学和转录组学的研究也取得了突破性进展。Li等［20］发现激素的应用促使骨细胞内PPARgamma2基因的表达增加了2倍，Cbfal／Runx2及骨钙蛋白基因表达下降了近50%，结果使骨髓内未定型的骨祖细胞向脂肪细胞分化导致最终发生骨坏死。Liu等［21］发现部分家族性ONFH与12号染色体的基因突变有关，他们对3个常染色体显性遗传的ONFH家族所有成员的12q13.11-q13.2区域的COL2A1基因进行DNA测序分析，发现所有发病者COL2A1基因的外显子均出现碱基转变，从而使表达Ⅱ型胶原GXY区域的核苷酸序列发生改变导致软骨中Ⅱ型胶原功能缺损。他们认为COL2A1的基因突变在ONFH的发病机制上起了至关重要的作用。此外，Hirata等［22］还通过PCR-RFLP和RT-PCR的方法检测肾移植术后ONFH病人的ApoAl和ApoB基因，认为ApoBC7623T与ONFH存在显著相关，并认为ApoBC7623T、BCBlC3435T和CBP(rs3751845)可作为肾移植术后发生ONFH的预测因子。

    多项药物基因组学的研究还发现ONFH与特定的遗传多态性有关。Chao等［23］对酗酒合并ONFH、胰腺炎、肝硬化病人的多种乙醇代谢酶进行测定，在骨坏死组中等位基因ADH2*1出现的频率低于肝硬化组，但与胰腺炎组比较未见明显差异；然而在同时合并骨坏死与肝硬化的病例中等位基因ADH2*1出现频率比同时合并骨坏死及胰腺炎组高。作者认为这种差别与病例之间其他方面的遗传变异有关。另有作者认为药物转运蛋白P-糖蛋白可以解释为何高剂量的糖皮质激素容易引起骨坏死，他对136例肾移植病人中30例出现ONFH的病人的多元耐药基因1  (ABCBl，MDRl)进行单核苷酸多态性评估，发现ABCBl 3435TT基因型的病人骨坏死的发生率较低，而在ABCBl 3435CC及3435CT基因型的病人中其发生率显著增高，作者提供了在3435TT基因型病人中P—糖蛋白活性增加的证据，并可以解释细胞内特定组织中类固醇增高的原因。这不仅为了解激素相关性骨坏死的发病机制提供了理论依据，更有利于筛查高危人群［24］。

    4  非创伤性ONFH与蛋白质组学研究

    国内外对ONFH的发病机制的研究仍处于探索阶段。以往细胞学、基因组学平台上的研究已不能满足探索ONFH未知领域的要求，人们迫切地需要新兴的分子生物学技术来开拓一个崭新的科技研究平台，蛋白质组学由此应运而生。

    目前蛋白质组学在临床医学领域上已有较广泛的应用，尤其在泌尿系统肿瘤、消化道肿瘤方面，国内外已利用生物质谱技术完成对人类常见疾病如肝癌细胞系蛋白质的肽段分析，并成功地找到相关的血清标志物。然而蛋白质组学在ONFH的相关研究甚少。国内有人最近通过双向凝胶电泳(2-DE)及MALDI-TOFMS的方法在ONFH的血清中筛选出部分可能有意义的血清标志物t-PA、PAI-1和抗p53抗体［25］，为将来筛选骨细胞中的差异表达蛋白提供了良好的基础。由于常规的差异表达蛋白的研究建立在2-DE技术和生物质谱技术的基础之上，而2-DE存在了低分子量检测和低丰度蛋白质的灵敏性等问题，因此建立一条研究ONFH高通量蛋白质组学的技术路线将是未来非创伤性ONFH基础研究的方向。

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