编织聚乙烯醇支架材料构建前交叉韧带的生物相容性和力学性能分析
作者：白利明， 陈鸿辉， 叶春婷， 邹海燕， 戴丽冰， 张鸣生
【摘要】 ［目的］通过对编织聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）材料的生物相容性和力学性能的分析，初步探讨使用该材料构建组织工程前交叉韧带支架的可行性。［方法］将体外分离培养的人前交叉韧带细胞和NIH3T3细胞分别种植在编织构建支架材料上进行立体培养，观察细胞在支架材料上的生长情况；然后使用拉力机对支架材料进行力学性能测试并进行分析。［结果］细胞在支架材料上生长良好，并分泌细胞外基质；支架材料的最大负荷、最大应变和极限抗张强度分别达169.78±9.18N、11.67%±1.38%、52.21±2.88 MPa。［结论］该支架材料具有优良的生物相容性和一定的力学性能，有望通过改进力学性能后成为一种较理想的组织工程前交叉韧带支架材料。
【关键词】 聚乙烯醇； 支架材料； 编织； 生物相容性； 力学性能； 膝前交叉韧带
Abstract：［Objective］To investigate the feasibility of the fabrication of tissue?engineered anterior cruciate ligament (ACL) in vitro by studying biocompatibility and mechanical property of the braided polyvinyl alcohol (PVA) materials.［Method］Firstly, human ACL cells and NIH3T3 cells were isolated, expanded in vitro and seeded onto the surface of the braided PVA scaffold materials, the adhesion, proliferation and three?dimensional growth of cells on the scaffold were observed by SEM. Secondly, the biomechanical properties of the braided PVA scaffold materials were measured with electro?biomechanical machine.［Result］The braided PVA scaffold materials had no cytotoxicity, ACL and NIH3T3 cells adhered, grew and proliferated well both on the surface and in the holes of the braided PVA scaffold materials. The maximum load, the maximum strain and ultimate tensile stress of the braided PVA scaffold materials respectively were 169.78±9.18N, 11.67±1.38% and 52.21±2.88MPa.［Conclusion］The braided PVA scaffold materials possess good biomechanical properties and biocompatibility, it may become an ideal biomaterial for fabricating tissue?engineering ACL if the biomechanical properties can be improved.
Key words：polyvinyl alcohol(PVA); scaffold material; braiding; biocompatibility; mechanical property; knee; anterior cruciate ligament(ACL)
前交叉韧带断裂是最常见的膝关节损伤之一。ACL实质撕裂常无法自愈，使用自体或异体移植物在关节镜下重建ACL是目前常用的方法［1］。自体移植物来源有限且存在供区部位并发症；异体移植物也受来源限制，还有传播疾病和产生免疫排异的风险；人工韧带材料重建ACL的远期疗效还存在争议，限制了其临床应用。组织工程技术的和应用为ACL重建提供了新思路和方法。 本文拟使用聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）纤维编织构建韧带支架材料，通过分析支架材料的生物相容性和力学性能，探讨使用该材料构建膝前交叉韧带支架的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料与主要仪器
1.1.1 主要材料 聚乙烯醇（进口分装，分子式｛(C2H4O)｝n，平均聚合度124，水解度97%），DMEM培养基 (Gibco, USA)，I型胶原酶(Gibco, USA)，Ⅰ、Ⅲ型胶原兔抗人或鼠多克隆抗体、即用型免疫组化SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）等。
1.1.2 主要仪器 电子拉力测试机（H25KS?S, Hounsfield Test Equipment Ltd，UK），扫描电镜（PHILIPS, ESEM?30），激光共聚焦显微镜(ZEISS 510Meta，Germany)，倒置相差显微镜(IMT?2，OLMYPUS，Japan)，图像分析仪（Axio Vision，Germany）等。
1.2 方法
1.2.1 ACL细胞的体外分离培养和鉴定
1.2.1.1 无菌取膝骨性关节炎患者未受损的ACL组织，按照组织块和胶原酶消化培养法［2］在体外分离培养并扩增ACL细胞。
1.2.1.2 将培养2～3代ACL细胞进行吖啶橙（acridine orange, OA）染色，在激光共聚焦显微镜下观察ACL细胞的形态特征。
1.2.1.3 在ACL细胞中加Ⅰ、Ⅲ型胶原单克隆抗体（浓度为1∶200），阴性对照加PBS。按照SABC免疫组化试剂盒的步骤检测ACL细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原的情况。
2.2 编织支架材料接种细胞前处理
将编织成形的支架材料修剪成约21 mm×2.4 mm×1.4mm大小，分别经过0.1 mol/L稀盐酸、0.1 mol/L氢氧化钠和蒸馏水超声洗涤5次，置入6孔培养板包装后，经60Co辐照（剂量6 kGy，8 min）灭菌，然后用DMEM培养基充分浸泡24 h，在接种细胞前再用无血清的DMEM培养基反复洗几遍，备用。
2.3 编织支架材料接种细胞并观察
取3～5代ACL细胞和NIH3T3细胞分别进行消化，制成细胞悬液（浓度为1×105/ml），种植于编织支架材料上，在37℃、5%CO2培养箱内孵育2 h，再复种1次，然后在培养箱内静置培养6 h，加入足够培养基，以后每隔2 d换培养基1次，分别在第3、7 d收集支架材料－细胞复合物。
种植NIH3T3细胞的支架材料－细胞复合物经过0.01 mol/L PBS清洗，0.01%吖啶橙染色，在激光共聚焦显微镜下观察细胞在支架材料上的生长情况；种植两种细胞的支架材料－细胞复合物分别经过0.01 mol/L PBS清洗、2.5%戊二醛固定、梯度酒精脱水、醋酸异戊酯置换、CO2临界点干燥、喷金，在扫描电镜下观察细胞在支架材料上的生长情况。
2.4 聚乙烯醇纤维丝的制作
称取一定质量的PVA粉末，用75%酒精浸泡48 h充分溶胀后，去除部分杂质，再用蒸馏水反复冲洗多次，除去残余的酒精，按20%（w/v）比例加蒸馏水后，在70～80°C水浴加热使PVA溶解，配制成20% PVA溶液，然后高速离心（18 000 r/min, 20 min）去除杂质。20%聚乙烯醇溶液经过喷丝（上海东华大学材料研究所协助制作），制作聚乙烯醇纤维丝材料。
2.5 编织构建前交叉韧带支架材料
使用两种方法编织构建韧带支架材料：一种方法是将PVA纤维经过钩花后形成有孔的单条丝束，以每4条丝束为1股，以3股这样的丝束，编织构建韧带支架材料；另一种方法是将20条PVA纤维平行编成1股作为编织的丝束，用3股这样的丝束，编织构建韧带支架材料。
2.6 编织支架材料的力学性能测试 各取8条两种不同的韧带支架材料均经0.2 mol/L PBS（PH7.4）充分浸泡48 h后进行力学测试，使用游标卡尺测量材料中间部分的长、宽和厚度（测量3次，取平均值），其横截面积，在电子拉力机上以100 mm/min的速度进行单轴拉伸力学测试，使用电子拉力机自带软件（QMAT Professional material testing software）计算支架材料的极限抗张强度、最大拉应力、最大负荷、弹性模量等力学性能指标，使用SPSS11.5软件包分析测量结果并绘制负荷—拉伸曲线和应力—应变曲线，分析支架材料的力学性能。
2 结 果
2.1 ACL细胞的形态学特征
在体外培养的条件下，ACL细胞贴壁生长。细胞呈梭形，核呈圆形或卵圆形，位于细胞质的中央，与典型的成纤维细胞形态相似；2～5代ACL细胞增殖最为旺盛。细胞的形态主要以梭形为主，核呈圆形或卵圆形，位于细胞中央，胞质可向外伸出数个长短不等的突起，呈典型的成纤维细胞特征（图1～2）。
2.2 ACL细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达
Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白免疫组化结果显示：所有滴加一抗的细胞，核呈浅蓝色淡染，胞浆内含有丰富的棕黄色颗粒，主要分布在细胞核周围，胞浆外无棕黄色颗粒出现（图3～4），表明胞浆内含有较多由ACL细胞分泌的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，所培养的细胞为韧带成纤维细胞。
2.3 NIH3T3细胞在支架材料上生长情况
激光共聚焦显微镜观察显示，支架材料上有大量的NIH3T3细胞生长，并可见细胞分泌基质（图5～6）；在扫描电镜下可见支架材料上有大量细胞生长，细胞呈圆形并伸出伪足在支架材料上黏附生长，随着时间增加，细胞分泌的基质不断增加（图7～8）。
2.4 ACL细胞在支架材料生长情况
扫描电镜显示，ACL细胞能在支架材料上黏附，细胞伸出突起附着于材料表面或孔隙内。细胞在材料上呈多角形或梭形，支架表面和孔隙内可见细胞分泌的胶原蛋白丝状物质。随着时间增加，细胞间相互连接成片状结构，分泌较多细胞外基质；部分孔隙内可见胶原蛋白丝状物质相互连接成网状，丝状物的排列较乱，没有一定的性（图9～10）。
2.5 两种编织支架材料的力学性能
两种不同的支架材料的力学性能测试结果如下（表1）。表1 两种不同的支架材料的力学性能测试结果
2.6 编织支架材料的应力—应变和负荷—拉伸曲线
根据电子拉力机软件系统分析绘制的支架材料典型应力—应变和负荷—拉伸曲线呈非线性曲线（图11-12）。
图1 倒置相差显微镜观察组织块培养的原代ACL细胞的形态 100× 图2 AO染色激光共聚焦显微镜观察ACL细胞的形态学特征 100× 图3 ACL细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白 LM 200× 图4 ACL细胞分泌Ⅲ型胶原蛋白 LM 200× 图5 NIH3T3细胞在支架材料上生长7 d，细胞生长良好，可见细胞分裂 100× 图6 NIH3T3细胞在支架材料上生长7 d，细胞生长良好，细胞并连接成片 100× 图7 NIH3T3细胞在支架材料上生长3 d，细胞生长良好 SEM 1500× 图8 NIH3T3细胞在支架材料上生长7 d，分泌较多细胞外基质 SEM 1000× 图9 ACL细胞在支架材料上生长3 d，细胞呈梭状，生出伪足黏附生长 SEM 445× 图10 ACL细胞在支架材料上分泌较多细胞外基质 SEM 1000 ×图11 纤维钩花编织支架材料的负荷－拉伸曲线 图12 平行纤维编织支架材料的负荷－拉伸曲线
3 讨 论
3.1 支架材料的生物相容性
目前，使用体外模拟实验是评价支架材料生物相容性的常用方法，可以在简化的模型表面上研究细胞的黏附、铺展、生长和生物化学活性等情况，从而评价其相容性［3］。本实验用膝ACL细胞和NIH3T3细胞接种于韧带支架材料上，通过观察细胞在支架材料上的生长及分泌细胞外基质情况，进而评价其生物相容性的优劣。
一般认为，亲水性材料有助于细胞黏附［4］。研究表明，PVA材料亲水性好，可以通过与黏附蛋白结合而增加细胞的黏附性，这对构建组织工程韧带支架材料十分重要，因为支架材料植入体内后，细胞首先与支架材料的表面发生相互作用。支架的细胞相容性是构建组织工程ACL的一项重要指标。
本实验观察到，ACL细胞和NIH3T3细胞均可在支架材料上黏附生长。ACL细胞呈梭形、多角形或不规则形，细胞NIH3T3呈圆形，细胞在支架材料上逐渐伸出伪足与之黏附，有些细胞之间彼此连成片状或网状黏附于支架材料。在支架材料的表面和孔隙内有较多细胞分泌的纤维丝状物质，纤维丝排列紊乱，没有性，这可能是由于支架－细胞复合物在体外共培养时缺乏像体内那样的应力环境，其生物学特性受到一定影响，因而其分泌的细胞外基质排列较为紊乱［5］。
James等［6］的实验也证实，ACL细胞在编织PLA支架材料上起初时呈圆形，随着培养时间的增加，细胞在支架材料上呈纺锤形或鞘膜状生长。支架材料上有较多网状结构的纤维丝状物质，ACL细胞能在支架材料上分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，其基因表达水平增高，可能有助于韧带组织的修复。本实验观察到的结果与Cooper等的相似，ACL细胞和NIH3T3细胞可在支架材料上黏附、增殖并能分泌细胞外基质，细胞在PVA编织支架材料上分泌的纤维丝状物质可能有助于韧带组织的修复和再生，进而说明支架材料具有良好的生物相容性。
3.2 支架材料的力学性能
构建组织工程韧带的一个重要标准就是要求支架材料具有良好的力学性能，而且其力学性能最好能与韧带相似，随着支架材料降解，其力学性能可以逐渐转移到新生的韧带组织。这样，韧带重建后就可以提供较强的初始抗张强度、最大负荷等力学性能，其功能也可立即恢复到损伤前水平并能进行早期康复功能锻炼，随着组织再生以及力学性能转移和加强而达到修复重建的目的。
支架材料的力学性能理论上应与人ACL的拉伸力学测试曲线相似，应具有非线性变化的粘弹性材料特征。本实验中使用两种方法编织构建的支架材料，经过单轴拉伸力学测试，其应力－应变曲线和负荷－拉伸曲线均具有非线性变化的特征，从曲线中可以清晰地看到脚趾区、线性区和断裂区，支架材料具有与韧带组织相似的力学变化特征。
本实验还发现，使用平行纤维丝束编织的支架材料，其各项力学测试指标均比纤维钩花后编织的支架材料增加，这可能是由于该材料中纤维排列方向更为一致，对抗拉伸负荷的力量增加，因而其力学性能也增加，支架材料的极限抗张强度达52.21±2.88 MPa，比未编织的PVA/COL膜性支架材料的极限抗张强度高［7］，其极限抗张强度已达到了人膝前交叉韧带的力学要求。
3.3 PVA材料编织构建组织工程前交叉韧带的可行性
构建组织工程ACL的关键是要选择合适的支架材料。理想的支架材料应该具有良好的生物相容性和具有优良的力学性能。本实验将ACL细胞和NIH3T3细胞种植于支架材料上，细胞可以在支架材料上黏附、增殖并能分泌纤维丝状物质，表明材料具有较好的细胞相容性。
支架材料的力学性能分析表明，编织支架材料的力学性能明显提高，其力学拉伸曲线具有与韧带组织相似的非线性变化的特征，材料的极限抗张强度达到了人前交叉韧带的力学要求，但其它力学性能仍需要进一步改进。
应用编织技术是构建组织工程ACL的趋势之一。编织支架材料可以较好地模拟ACL纤维走向，大大改善了力学性能。两端骨隧道部分和关节内部分的纤维可以形成不同的孔径结构，有利于新生组织长入，为韧带血管化和再生创造了条件［8］。James等［6］的试验也证实，使用PLLA纤维编织构建的ACL支架材料的最大负荷可以满足人正常生理活动的需要。ACL细胞可以在支架材料上黏附、增殖和分泌细胞外基质。编织支架材料还可以形成不同的孔径结构和较高的孔隙率。
有研究认为［6］，支架材料的结构性质对细胞的黏附和生长有重要的影响。在编织构建韧带支架材料时可以将材料两端骨隧道部分的孔径结构设计为100～150 μm左右，以便于骨组织和钙化组织长入而达到牢靠的生物学固定，而支架材料在关节腔内的部分，孔径结构可略大些，以便诱导软组织长入而达到修复韧带功能的目的。
本实验的编织支架材料在技术上还难以达到这样的孔径结构和孔隙率要求。有研究表明，使用机械编织可以调整编织的角度和纤维的松紧度，有可能编织出具有合适孔径结构、较高孔隙率和力学性能优良的支架材料。因此，改进编织技术，使用可控的机械编织是改进材料力学性能的有效方法。
综上所述，用PVA编织构建的支架材料具有细胞相容性。编织材料可以形成具有孔径结构的三维支架，材料的力学性能明显提高，其极限抗张强度已达到了前交叉韧带的力学要求。ACL细胞和NIH3T3细胞可以在支架材料上黏附、增殖和分泌细胞外基质。如能改进材料的制备、纺丝和编织技术，或辅助以其他力学性能较高的生物材料聚合物等以提高其力学性能和生物相容性，有望发展成一种构建组织工程ACL的新支架材料。
4 致 谢
非常感谢广州市创伤研究所陈鸿辉老师、邹海燕老师和叶春婷老师对的设计和指导；感谢戴丽冰老师对实验的指导和帮助；感谢广州市创伤研究所为实验提供所有的数据、材料和图片；感谢张鸣生主任对论文书写的指导。
【】
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