两种接种密度骨髓基质干细胞复合β?TCP对兔腰椎横突间融合的效果

                作者：潘玮敏，胡蕴玉　陈俊伟，郑芬芳，郑振耀，毕龙

【摘要】  [目的]观察两种不同接种密度的骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells ，BMSCs)，在成骨诱导分化后复合β?TCP应用于兔腰椎横突间脊柱融合的术后融合效果。[方法]应用BMSCs/β?TCP复合体对随机分为两组(低密度接种组和高密度接种组)的实验兔进行腰椎横突间非去皮质骨脊柱融合术，观察两组动物术后大体腰椎融合率、影像学特征、骨矿含量(bone mineralization content，BMC)，骨密度(bone mineralization density,BMD)和矿化组织体积(bone mineralization tissue volume，BMV)及组织形态学变化。[结果]与低密度接种组比较，高密度接种组术后融合率明显提高，可达到71.4%(P<0.05)。显微CT图像结果显示高密度接种组横突间不仅新骨形成量多,而且融合稳固，且其BMC、BMD和BMV及新骨生成率均高于低密度接种组(P<0.05)。[结论]使用接种密度为10×106 cells/ ml的人工骨具有较好的融合效果，融合率可达到71.4%，这一点为临床应用BMSCs复合生物材料体外构建人工骨应用于非去皮质骨脊柱后路融合有一定的指导意义。

【关键词】  骨髓基质干细胞; β?TCP; 脊柱融合

　　Abstract：[Objective]To investigate the effects of two different densities of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) combined with β?TCP on spinal fusion in rabbits.[Method]Spinal fusion surgery of lumber intertransverse process were performed using MSCs/β?TCP as a graft in two groups of rabbits (low density group versus high density group),and rate of lumbar fusion,image characteristics,bone mineralization content，bone mineralization density，bone mineralization tissue volume and rate of new bone formation were observed.[Result]Compared with the low intensity group,the rate of lumbar fusion was greatly improved in the high density group(P<0.05),and the values of BMC,BMD,and BMV,and the rate of new bone formation were also higher in high density group(P<0.05).[Conclusion] β?TCP combined with BMSCs of the density of 10×106 cells/ ml could enhance spinal fusion and this could guide the surgeons as to that one of the densities is more suitable in clinical practice.

　　Key words：bone marrow mesenchymal stem cells; β?TCP; spinal fusion

　 由于促进椎体间融合及增强脊柱稳定性的效果可靠，腰椎融合术中进行植骨在临床上得到广泛应用。植骨材料中，自体骨及同种异体骨应用受到诸多因素限制[1]，人工支架材料的研制成为热点。但单纯依靠支架材料难以实现良好的骨融合效果，因此学者尝试将支架材料与具有成骨分化能力的骨髓基质干细胞(BMSCs)复合以改善融合效果[2]。

　　体外实验中发现不同的BMSCs细胞接种密度可能导致不同的成骨效果[3]。然而目前对于不同密度BMSCs复合生物材料对脊柱融合效果影响的研究较少。本实验使用两种接种密度的BMSCs，在成骨诱导分化后，复合β?TCP应用于兔腰椎横突间脊柱融合，研究术后融合效果，以期为临床应用提供。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　新西兰大白兔20只，雄性，体重2.3～2.5 kg，香港中文大学实验动物中心提供。DMEM培养基、10%胎牛血清、1%的青霉素，链霉素及新霉素混合液均购自美国Invitrogen公司。地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸购自美国Sigma公司。β-TCP载体购自美国Synthes公司。

　　1.2 BMSCs/β?TCP复合体的体外构建

　　将14只新西兰白兔随机分为两组，即低接种细胞密度组(LD group,n=7)和高接种细胞密度组(HD group,n=7)。分别从两组动物股骨近端抽取自体骨髓，每只动物吸取8 ml骨髓，PBS液漂洗后，1 000 r/min离心10 min，弃上层悬浮脂肪细胞。将其移至含有10%胎牛血清、1%的青霉素、链霉素及新霉素混合液的DMEM培养液中，种植于75 cm2的培养瓶中，在37℃、含有5%CO2的培养箱中传代扩增培养，2周后更换加入10-8 mol/L 地塞米松、10 mmol/L β?甘油磷酸钠和0.25 mmol/mL抗坏血酸诱导成骨培养液培养1周，ALP酶染色结果显示阳性，提示BMSCs已向成骨细胞方向分化。

　　消化离心分别制成5×106/ml和10×106/ml密度的细胞悬液准备细胞种植。β?TCP载体长30 mm、宽8 mm、高6 mm,将两种不同密度细胞悬液分别以0.05 ml/块滴入载体表面(8 mm×30 mm)，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下静置18～24 h，随即进行植入手术。

　　1.3 复合体植入

　　植入手术均采用椎旁后入路。沿椎旁外侧肌间隙显露L5、6横突及其横突间区域，术中注意保持横突间筋膜的完整性，直接将植入物滴加细胞面放入融合位置，横突位置不作打磨钻孔及去皮质骨处理，并妥善放置肌肉用以固定，术毕逐层缝合。动物分笼饲养，自由进食和饮水，观察并记录术后情况。术后第8、10周分别给予二甲酚橙(90 mg/kg体重)和钙黄绿素(5 mg/kg体重)皮下注射,进行活体荧光标记。术后12周处死实验动物取材。

　　1.4 大体观察

　　术后常规观察饮食、活动及伤口愈合情况，同时拍摄X线片。取材后，去除椎体间及材料植入部位肌肉和软组织，进行植入物硬度和腰椎活动度检测，无活动判定为融合，有活动判定为不融合。

　　1.5 显微CT(Micro?CT)检测

　　应用显微CT(μ40)扫描重建3-D影像，观察融合状况。

　　1.6 pQCT检测

　　待标本固定后使用pQCT测量横突及移植物下与横突接触面的骨矿含量(BMC)、骨密度(BMD)和矿化组织体积(BMV)。

　　1.7 荧光显微镜检测

　　制备不脱钙切片，通过荧光显微镜对矿化过程进行观察，并通过图像分析软件Imageproplus 6.0进行测量分析。

　　1.8 统计学分析

　　采用 SPSS 11.0统计软件进行统计分析，数据表示为均数±标准差。两组标本检测数据的比较均采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 术后一般情况

　　术后两组实验动物均存活，无死亡情况发生。术后2 d内饮食及生活习性逐渐恢复如常,伤口无红肿、化脓等炎性反应，未见植入物的排异现象,切口均完全愈合。X线片示术后TCP未见移位等现象发生。

　　2.2 手触检测

　　术后12周取材，大体观察及手触检测发现HD组7例样本中5例融合，材料植入部位具有明确成骨,融合率约为71.4%，高于LD组。而LD组7例样本中仅有1例融合，其余标本L5、6椎间关节活动自如,融合率仅为14.3%(P<0.05)。

　　2.3 影像学结果

　　Micro?CT图像结果：通过Micro?CT的3-D图像观察分析证实(图1)，HD组7例样本中5例示横突间有融合骨质，不仅新骨形成量多,且融合稳固。LD组7例样本中仅1例有融合，其余样本示植入区基本无新骨形成及骨性融合。

　　图1 MicroCT的3-D图像分析结果

　　2.4 pQCT 测量结果

　　本实验中应用pQCT,主要是测量矢状面中横突及横突与移植物接触面的BMC、BMD和BMV，结果发现HD组三组数值均明显高于LD组，且数值之间差异均具有统计学意义(P<0.01)。表1 pQCT 测量结果注：与HD组比较，*P<0.05; **P<0.01

　　2.5 组织形态学计量结果(图2)：

　　新骨生成率(new bone formation rate)通过测量两次标记线的间距和已知标记间隔的时间即可求得，这是最常用来计算骨重建速率的指标。作者通过不同的荧光标记对于两组的成骨率进行测量计算得知，HD组为0.031±0.003; LD组为0.025±0.003，两组数据之间具有显著性差异(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　脊柱融合术中，植骨是重要的环节。在众多研究的植骨材料中，多孔生物陶瓷材料β?TCP具备良好的生物相容性和机械强度，在体内可降解吸收，但其只具有骨传导性，而无诱导成骨作用。因此在脊柱融合术中，常在去皮质骨的同时植入β?TCP，去皮质骨区域血液和渗出液中的多种诱导物质可增强其成骨诱导能力，促进新骨的形成，但是实验及临床应用的结果不理想。许卫兵等将骨髓基质干细胞(BMSCs)与β?TCP复合后应用于胸椎后侧融合，发现融合效果明显提高[5]，提示去皮质骨脊柱融合术中，将BMSCs与β?TCP复合，可通过骨传导作用与自身成骨作用相结合提高融合效果。

　　图2 荧光标记示意图

　　然而在前期实验中，采用BMSCs与β?TCP复合，对兔进行了腰椎后路去皮质骨的融合手术，术后检测虽然发现取得较好的融合效果，但是去皮质骨手术过程中存在出血较多、暴露范围较大和手术时间较长等缺陷[6]。有鉴于此，本实验考虑采用非去皮质骨术式，即不通过打磨钻孔等方式进行去皮质骨，而是通过增高BMSCs初始接种密度以达到增强融合效果的目的。作者将两种不同密度的BMSCs接种在与前期实验相同体积的β?TCP支架材料上，体外构建人工植骨材料，应用于腰椎后路融合术，发现高密度细胞接种组术后融合效果明显比低密度细胞接种组得到提高。

　　学者们通过不同的实验发现，BMSCs的成骨分化受到诸多因素的影响，初始接种密度即是其中之一。而且证实BMSCs在体内成骨的效果是随接种密度增加而提高，但存在一个阈值，超越此阈值反而不利于BMSCs的成骨[9，10]。然而其实验采用的细胞来源不同、载体材料不同、动物模型也不同，因此对于BMSCs在体内发挥最大成骨效应的适宜接种密度尚未有定论，特别是在脊柱融合手术中，BMSCs应用的最佳初始接种密度更无法确定。本实验在借鉴基础上[7，8]，作者前期实验结果[4，6]，采用了两种接种密度，即5×106/ml与10×106/ml，将其分别与β?TCP复合，结果发现随接种密度的增加，融合效果明显提高，骨生成量增加，骨生成的过程明显加速。其他学者的实验有采用细胞与材料共培养后再植入体内[11]，采用这种植入方式，实际植入材料中的细胞数目并不确定。本实验中BMSCs经成骨诱导培养后再与材料复合，即在植入前就规范了诱导后的BMSCs密度，利于评估初始接种密度。 本研究将不同接种密度的BMSCs与β?TCP载体复合构建人工骨，应用于非去皮质骨手术的脊柱后路融合。结果证实,接种密度为10×106cells/ ml的人工骨具有明显的融合效果，融合率可达到71.4%，而低密度接种组融合率仅为14.3%，差异非常显著。这一点为今后进一步研究BMSCs复合生物材料体外构建人工骨应用于非去皮质骨脊柱后路融合提供了有力的实验依据。

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　　[5] 许卫兵,贾连顺,卢建熙，等.兔骨髓基质干细胞体外培养复合β-磷酸三钙进行胸椎后侧融合实验研究/[J/].矫形外科杂志,2005,13:1736-1738.

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