大鼠急性脊髓损伤后Caspase?3、Cathepsin B的表达

              作者：崔开, 韩亚新, 孔冉冉, 董君博, 张国栋, 梁 栋, 屠冠军

【摘要】  [目的]研究大鼠急性脊髓损伤后Caspase?3、Cathepsin B的表达,并初步探讨Caspase?3、Cathepsin B在脊髓损伤后表达的意义。[方法]将78只成年健康SD大鼠按Nystrom法建立大鼠脊髓(T8 、T9)急性压迫损伤模型, HE染色观察脊髓组织病变化，免疫组化测定各时间点Cathepsin B、Caspase?3 的表达变化，原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸(dUTP) 标记法(TUNEL 法) 检测神经细胞的凋亡水平。[结果]免疫组化结果显示正常及假手术组大鼠脊髓神经细胞中Caspase?3，Cathepsin B，TUNEL阳性细胞较少;在脊髓损伤后3 d Cathepsin B阳性细胞数明显增多，5 d达高峰，7 d未见明显衰减。Caspase?3阳性细胞数在脊髓损伤后8 h明显增多，3 d达高峰，7 d表达减弱。TUNEL阳性细胞数也在8 h明显增多，3 d达高峰，7 d表达减弱。Cathepsin B阳性细胞形态及表达的部位均与Caspase?3阳性细胞、TUNEL阳性细胞差别较大。[结论]Caspase?3参与了脊髓损伤细胞凋亡的调节，Cathepsin B则可能通过炎性细胞为媒介参与了脊髓继发性损伤。

【关键词】  脊髓损伤; 细胞凋亡; Cathepsin B; Caspase?3

　　Abstract：[Objective]To study the expression of Cathepsin B,Caspase?3 and to explore the significance of their expression initially after acute spinal cord injury in rats.[Method]The spinal cord injury of the healthy adult SD rats (78) was induced with Nystrom’s way by the moderate compression at the level of T8 and T9 spinal cord. HE methods were used to detect the pathologic change of spinal cord. The expression of Cathepsin B and Caspase?3 were detected by immunohistochemical study. Besides,using the terminal deoxynucleotidyl transferase mediated DUTP nick and labeling (TUNEL) methods to detect the level of the apoptosis of neural cells.[Result]There were few expressions of Cathepsin B, Caspase?3 and TUNEL positive cells in normal and sham operated spinal cord as detected by immunohistochemical study. The number of positive cells of Cathepsin B increased clearly at 3 days,reached a peak at 5 days,and was constant at 7 days after injury. While the expression of Caspase?3 increased obviously at 8 hours,got to a peak at 3 days，and was lowest at 7 days. And the number of positive cells of TUNEL also increased obviously at 8 hours，got to a peak at 3 days，and was lowest at 7 days. There were significance differences of morphological and position of positive cells between Cathepsin B and Caspase?3 or Tunel. [Conclusion]Caspase?3 protein expressions are enhanced in combination with neuronal apoptosis,while Cathepsin B may involve in the secondary injury by inflammatory cells after acute spinal cord injury.

　　Key words：spinal cord injury; apoptosis; Cathepsin B; Caspase?3

　　急性脊髓损伤是外科中常见的损伤，后果严重且恢复困难，脊髓原发性损伤后的继发性损伤扩大了损伤范围，加重了损伤程度。是脊髓损伤后影响脊髓修复的重要病理过程。脊髓继发性损伤的过程十分复杂，其中细胞内外环境的改变会导致各种酶类的激活，对组织造成进一步的损害。

　　Cathepsin B属于半胱氨酸蛋白酶，在生理情况下主要存在于溶酶体内，发挥其蛋白水解作用。近年来的研究表明，受到某种外界条件的刺激后，Cathepsin B从溶酶体内释放到胞质中参与炎症、肿瘤侵袭和转移、细胞凋亡等诸多病理过程[1,2]。Caspase?3 是Caspase家族蛋白酶的一种，被称为凋亡的执行蛋白，在细胞凋亡过程中发挥极其重要的作用，是细胞凋亡的敏感指标。该实验通过建立大鼠急性脊髓损伤模型，应用免疫组化技术检测不同时间点Cathepsin B、Caspase?3的表达情况,并初步探讨二者在脊髓损伤后表达的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　羊抗大鼠Cathepsin B多克隆抗体(Santa?Cruz,CA);羊抗大鼠Caspase?3多克隆抗体、TUNEL凋亡试剂盒(武汉博士德公司)，兔抗羊IgG、S?P免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒(福州迈新)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠急性脊髓损伤动物模型的建立及分组 取健康成熟SD大鼠78只，雌雄不限，体重220～250 g,由医科大学实验动物中心提供。随机分为：损伤组：脊髓损伤后分2、8 h，1、3、5、7 d 共6个时间点,每个时间点6只;假手术组:单纯椎板切除术后2、8 h，1、3、5、7 d共6个时间点，每个时间点6只;空白对照组6只，不做任何处理。模型制备：10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔内注射，俯卧位固定，无菌原则下进行背正中切口，切除T8、9椎板，暴露硬脊膜，整个过程保证硬脊膜的完整。按Nystrom法将35 g重物通过2.2 mm ×5 mm弧形光滑金属垫片压迫该段脊髓后正中部5 min，分层缝合，碘伏消毒。损伤后，每天人工排尿(便)2次，局部消毒1次。

　　1.2.2 取材及切片制备 各组大鼠分别于脊髓损伤后各时间点取材，麻醉后剖胸，经左心室-主动脉插管，4%多聚甲醛灌流固定。以伤处为中心取1.5 cm脊髓组织，多聚甲醛浸泡固定。常规蜡块包埋，连续切片数张(纵切)，片厚6 μm，分别行HE、免疫组化染色及TUNEL标记。

　　1.2.3 免疫组织化学染色 每只大鼠取12张切片，按SP试剂盒说明书分别测定Cathepsin B，Caspase?3的表达:常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理、高温修复、血清封闭、滴加一抗过夜(浓度均为1:150),并同时用PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜、隔日滴加二抗孵育20 min、SABC 37℃孵育20 min，继而二氨基联苯胺(DAB)显色,镜下观察显色背景。以上各步骤间均用0.01 mol/LPBS漂洗3次，每次5 min，而后苏木素复染，蒸馏水冲洗，梯度酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。光镜观察脊髓组织变化，以细胞浆和/或核棕黄色着色为阳性细胞，每张切片分别于灰质、白质各取5个视野(×400)，分别计数每个视野的阳性细胞数。

　　1.3 统计学分析

　　采用SPSS11.5软件包进行统计,各组数据采用±s表示，Cathepsin B、Caspase?3阳性细胞数及神经细胞凋亡细胞数各组比较采用方差分析。以P<0.05为有差异, P<0.01为有显著性差异。

　　2 结 果

　　2.1 HE

　　光镜下观察可见正常和假手术组，神经元结构形态规则，白质致密(图1、2)。损伤后2 h，损伤段灰质出现明显出血灶(图3)。损伤后8 h，出血灶较2 h减少，开始出现一些炎性细胞。1～3 d脊髓破坏严重，白质松散不规则，3 d时损伤区域有扩大趋势，损伤区出现大量炎性细胞浸润，5～7 d损伤区域未有明显改变，仍有大量炎性细胞浸润(图4)。

　　2.2 TUNEL

　　凋亡细胞呈棕褐色和棕黄色，胞核固缩颗粒深染，形态不规则，为散在和弥散性分布于损伤区域周围。正常组和假手术组少见凋亡细胞(图5、6)，损伤后8 h开始出现大量凋亡细胞，1 d时凋亡细胞继续增多，3 d达高峰(图7)，5～7 d凋亡细胞逐天减少。

　　2.3 Caspase?3的表达

　　Caspase?3阳性细胞棕黄色，为胞浆和胞核着色，散在和弥散性分布于损伤区域周围。正常组和假手术组阳性细胞少见(图8、9)，8 h开始出现大量阳性细胞，3 d达高峰(图10)，7 d时阳性细胞减少。

　　2.4 Cathepsin B的表达

　　Cathepsin B主要表达在胞浆，为棕黄色。正常对照组及假手术组各时间点可见少量Cathepsin B阳性细胞(图11、12)，阳性物质主要表达于神经元细胞。脊髓损伤后3 d阳性细胞数明显增多，5 d时阳性细胞达到高峰期可见大量的阳性细胞出现在损伤区域(图13)，7 d阳性细胞数未见有明显减少， 阳性物质表达于大量的炎性细胞。

　　3 讨 论

　　急性脊髓损伤后的病理变化分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤主要指机械性外力对脊髓组织造成的瞬间创伤，包括撞击、锐器伤等等，导致脊髓的断裂、挫伤、震荡等损害。继发性损伤是机体对原发性损伤后的反应，包括炎性反应、自由基蓄积、细胞凋亡加快等一系列生化反应，其中脊髓损伤所造成的缺血缺氧环境，会干扰细胞正常的能量代谢导致细胞膜通透性降低、溶酶体通透性增加，从而使溶酶体内容物过度释放以及钙离子依赖的消化酶的激活，其中包括蛋白酶、磷脂酶、ATP酶等，对组织造成进一步的破坏[3，4]。

　　组织蛋白酶(Cathepsins)是一类主要存在于溶酶体中的细胞内蛋白酶,现已发现从A到Z多种,Cathepsin B是溶酶体中最重要的组织蛋白酶之一，属于木瓜蛋白酶家族，广泛分布于各种组织细胞的溶酶体中，在正常情况下与胞质的其他成分隔离开，在受到外界某种信号的刺激例如缺氧、炎症因子等刺激下，可以释放并渗透到胞浆或组织间隙，参与诸多的病理过程，对组织造成进一步的损害。Caspase家族蛋白酶即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶主要在细胞凋亡的调节过程中发挥重要的作用，其中Caspase?3是多种凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。被认为是凋亡调节过程中最重要的蛋白酶。

　　图1 正常对照组，HE染色，细胞形态规则，白质致密(HE×400倍) 图2 假手术组，HE染色，细胞形态规则，白质致密(HE×400倍) 图3 大鼠急性脊髓损伤2 h,HE染色损伤区域见大量红细胞(HE×400倍) 图4 大鼠急性脊髓损伤后5 d,HE染色损伤区域见大量炎性细胞浸润(HE×400倍) 图5 空白对照组，TUNEL染色，未见明显阳性细胞(HE×400倍) 图6 假手术组，TUNEL染色，未见明显阳性细胞(HE×400倍) 图7 大鼠急性脊髓损伤后3 d,TUNEL染色阳性细胞表达达高峰，阳性细胞胞核深染棕褐色(免疫组化×400倍) 图8 对照组，Caspase?3明显表达(HE×400倍) 图9 假手术组，未见Caspase?3明显表达(HE×400倍) 图10 大鼠急性脊髓损伤后3 d,Caspase?3表达达高峰，阳性细胞胞浆和/或胞核棕黄色(免疫组化×400倍) 图11 正常对照组，Cathepsin B也有表达，阳性细胞胞浆棕色，细胞数较少，细胞形态接近神经元细胞(免疫组化×400倍) 图12 假手术组，Cathepsin B也有表达，阳性细胞胞浆棕色，细胞数较少，细胞形态接近神经元细胞(免疫组化×400倍) 图13 大鼠急性脊髓损伤后5 d，Cathepsin B表达达高峰，阳性细胞胞浆棕色(免疫组化×400倍)表1 不同脊髓组中Cathepsin B、Caspase?3的表达，及TUNEL标记的阳性细胞数指标对照组假手术与对照组比较：△P <0.05，△△P<0.01 与假手术组比较：﹡P <0.05，﹡﹡P<0.01

　　对于大鼠急性脊髓损伤后Caspase?3与Cathepsin B的表达，以往的研究表明不同脊髓损伤模型中均存在着Caspase?3的表达上调，说明Caspase?3广泛介导了脊髓损伤后神经细胞的凋亡[5～7]。而在大鼠急性脊髓损伤后关于Cathepsin B表达的研究国内鲜有报道。但有研究表明Cathepsin B在其他中枢神经损伤模型中发挥重要作用，张延波等[8]研究表明脑缺血性损伤后，Cathepsin B的表达与Caspase?3的激活密切相关。P.J.Kingham等[9]则证实无论是应用嗜铬素A刺激小胶质细胞产生的Cathepsin B还是独立应用Cathepsin B均可导致神经元的凋亡和Caspase?3的激活。

　　本实验结果显示：在大鼠急性脊髓损伤后，Caspase?3的表达伴随了细胞凋亡的整个起落过程，Caspase?3阳性细胞与TUNEL所检测到的凋亡细胞无论是表达的高峰期还是表达的位置均大体一致，存在着时间和空间上的重叠。说明大鼠急性脊髓损伤后存在Caspase?3介导的神经细胞凋亡现象，这也验证了以往的研究。而Cathepsin B的表达无论是表达高峰期、表达的位置、还是阳性细胞形态，均与Caspase?3、TUNEL阳性细胞差别迥异，却与同时段HE染色炎性细胞浸润存在时间和空间上的重叠，主要表达于大量的炎性细胞中。以上表明大鼠急性脊髓损伤后，Caspase?3参与了神经细胞的凋亡过程，而与脑损伤后不同，本实验没有明确的证据支持Cathepsin B参与了神经元的凋亡。Cathepsin B主要通过炎性细胞为媒介，参与了脊髓的继发性损伤，对组织造成进一步的损害。但参与的具体机制和传导通路尚有待于进一步的研究。

　　综上，继发性损伤是大鼠急性脊髓损伤的重要组成部分，其损伤的范围远远大于原发性损伤。本实验验证了大鼠急性脊髓损伤后Caspase?3参与了神经细胞的凋亡，同时也证实了Cathepsin B在急性脊髓损伤后发挥的作用与其在脑损伤后不同，以炎性细胞为媒介参与了脊髓继发性损伤。为进一步了解蛋白酶在脊髓损伤后的作用提供了一定的实验依据。

【】
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　　[3] James W，Rowland BS. Current status of acute spinal cord injury pathophysiology and emerging therapies: promise on the horizon[J]. Neurosurg Focus, 2008,5:2.

　　[4] 刘世清，周 华，彭 昊，等.大鼠急性脊髓损伤后细胞凋亡的时空分布特点[J].矫形外科杂志,2003,24:1699-1700.

　　[5] Adjan VV, Hauser KF, Bakalkin G,et al. Caspase?3 activity is reduced after spinal cord injury in mice lacking dynorphin : differential effects on glia and neurons[J]. Neuroscience,2007, 3:724-736.

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　　[8] 张延波，陈溪萍，陶陆阳,等.大鼠脑外伤后溶酶体酶Cathepsin?B 和D 的表达[J].法医学杂志,2006,6:404-406.

　　[9] Kingham J, Pocock JM.Microglial secreted cathepsin B induces neuronal apoptosis[J]. Journal of Neurochemistry, 2001, 76:1475-1484.