高浓度棕榈酸对正常肝细胞株糖皮质激素受体α?亚型表达的影响

                        作者：吴青 龙洋 王蕴红 田浩明

【摘要】  目的： ：研究高浓度棕榈酸对肝细胞糖皮质激素受体α亚型（GRα）表达的影响。方法： 用含有10%小牛血清的低糖DMEM培养基培养正常肝细胞株L02。1.0×105细胞接种到6孔板中，并用含有200 mmol/L棕榈酸的低糖DMEM培养基培养72 h，24 h换液1次，用实时荧光定量PCR进行定量分析GRαmRNA。结果： 高浓度棕榈酸培养72 h后，肝细胞内GRαmRNA水平是对照组（用含10%、不含脂肪酸牛血清白蛋白的低糖DMEM培养基培养72 h）的1.67倍。结论： 高浓度棕榈酸可以刺激肝细胞GRα上调表达。

【关键词】  受体 糖皮质激素 代谢综合征X 肝细胞 棕榈酸类

代谢综合征（metabolic syndrome，MS）是一组代谢紊乱性疾病的总称，各种原因引起的糖皮质激素增多症或应用糖皮质激素都可能出现与MS相似的临床表现。Liu等[1]发现db/db糖尿病小鼠肝细胞糖皮质激素受体α亚单位（GRα）水平明显增加，同时发现高浓度葡萄糖上调体外培养原代肝细胞GR表达，在肥胖、MS、糖尿病等疾病状态下，肝脏GR表达水平上调，本研究通过体外肝细胞培养及实时荧光定量的方法，研究高浓度棕榈酸对肝细胞GRα表达的影响。

    1  材料与方法

    1．1  实验材料

    RNAiso Reagent、SYBR Premix Ex Taq购自天泰生物有限公司，RevertAidTM First Strand cDNA synthesis kit购自晶美生物有限公司，油酸、棕榈酸购自Sigma公司。低温高速台式离心机、电泳仪、PCR仪、荧光定量PCR仪。

    1．2  实验方法           

    1．2.1  细胞培养  L02正常肝细胞株用含10%小牛血清的DMEM培养基培养，当细胞生长至80%融合时，倾去培养液，用0.25%胰蛋白酶（含0.02 % EDTA?Na2）消化，以1∶2传代培养，采用生长融合成单层的细胞。按1.0×105个细胞接种于6孔板中，按下述实验分组对细胞进行刺激，24 h换液1次。在下述条件刺激72 h后，1 ml/孔RNAiso Reagent 提取细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取RNA的完整性。应用紫外分光光度法确定RNA 的浓度。细胞总RNA-80 ℃保存，用于后续实验。

    1.2.2  实验分组  对照组（NG）：正常浓度葡萄糖（5.56 mmol/L）；牛血清白蛋白组（BSA）：10%牛血清蛋白（不含脂肪酸）。高浓度游离棕榈酸组（OP）：含100 mmol/L油酸及100 mmol/L棕榈酸，配制方法参见[2]。

    1．2.3  逆转录生成cDNA  按照RevertAidTM First Strand cDNA synthesis kit试剂盒说明书对细胞总RNA（4 μg）进行逆转录反应，制备cDNA模板，用于荧光定量PCR。

    1．2.4  标准曲线制定和PCR测定  根据文献报道合成引物。P1：5’- CTTACTgCTTCTCTCTTCAgTTCCT -3’， P2：5’-gCAATAgTTAAggAgATTTTCAACC-3’。荧光定量PCR测定各组糖皮质激素受体mRNA水平，反应体系：SYBG Premix  Ex TaqTM 10 μl，上下引物各0.4 μl，模板1 μl，dH2O 8.2 μl；反应条件：95 ℃3 min，95 ℃ 10 s，51 ℃退火10 s，72 ℃ 10 s，50 个循环。

    1．2.5  GR基因标准品的制备  用紫外分光光度计对上述回收产物进行定量，倍比稀释得到102～107七个数量级的标准品，用于制作标准曲线。纯化参照基因（ABL）标准品的制备：用紫外分光光度计对上述回收产物进行定量，倍比稀释，得到10～105五个数量级的标准品，用于制作标准曲线。

    1．3  统计学分析

    采用SPSS 11.0软件对实验结果进行分析，计量资料以(x±s)表示，多组资料比较采用方差分析，两两比较采用最小显著差异法。P<0.05（双侧）认为有统计学意义。

    2  结果

    2．1  提取总RNA及初步鉴定

    通过琼脂糖凝胶电泳法对人肝细胞总RNA进行鉴定，电泳图3条带完整（见图1），分别为28 s、18 s、5 s。

　　2．2  RT?PCR扩增GR基因

    以逆转录cDNA为模板、P1和P2为引物进行PCR扩增，扩增产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳后显示出一条大小约为200 bp的DNA条带，与预计目的基因片段大小相符。以纯化参照基因ABL为模板，相应上下引物进行PCR扩增，扩增产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳后显示出一条大小约为100 bp的DNA条带，与预计目的基因片段大小相符。见图2。

　　2．3  荧光定量PCR检测结果

    GR表达水平以GR与ABL浓度的比值（GR/ABL）表示。对照组与牛血清白蛋白组之间的差异并不明显（GR/ABL分别为31.8和49.4），两者之间GR的表达水平差异无统计学意义（P=0.159）。高浓度游离棕榈酸组GR受体表达水平（GR/ABL为82.7）明显高于对照组及牛血清白蛋白组，差异具有统计学意义(P＜0.05），图3。

    2．4  标准曲线

    以102～107拷贝的纯化GR基因作为标准制备标准曲线，每个标准两个复管，结果显示重复性较好；对该标准曲线（图4）进行分析，显示其扩增效率良好（1.885）。以101～105拷贝的ABL作为标准作标准曲线，每个标准两个复管，结果显示重复性较好；对该标准曲线（图4）进行分析，显示其扩增效率良好（1.910）。

    2．5  扩增产物特异性

    对标准及样品的扩增产物进行95 ℃～37 ℃（以每0.2 ℃/s的速率降温）溶解曲线分析,发现标准及样品的溶解曲线均为单峰，且峰值单一，说A.对照组，B.牛血清白蛋白组，levels in 3 different groups明反应特异性较好（图5）；对标准及样品的溶解温度进行分析，显示GR标准Tm值为83.01，样品Tm值与其接近，说明样品与标准扩增产物一致；对标准及样品的溶解温度进行分析，显示参照基因ABL标准Tm值为82.84，样品Tm值与其接近，说明样品与标准扩增产物一致；GR基因与参照基因ABL扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，显示其长度分别为预期的200 bp和100 bp，无引物二聚体出现。3  讨论

    人类GR属于核激素受体超家族成员，是一种配体依赖的转录活化因子。人类GR可分为α和β两种亚型，两者是GR基因同一转录产物通过不同的剪切方式剪切的结果，GRα表达水平受自身调控和外源性调控。GR α与糖皮质激素结合后可通过自身调控机制在mRNA和蛋白质水平下调节自身表达[3]；GRβ通过与α亚型形成六聚体参与GRα的表达调控[4，5]。肥胖及代谢综合征糖皮质激素生物效应紊乱与糖耐量异常和胰岛素抵抗相关[6，7]，而且是发生2型糖尿病的危险因素[8]。肝脏特异性GR基因敲除小鼠以及肝脏GRα拮抗剂的应用均表现为糖异生异常[9，10]。此外，Herzig等[11]研究发现肝脏特异性缺失GRα可解除其对Hes1基因表达的抑制作用而改善肝脂肪变性的情况，减少甘油三酯在肝脏异常潴积。由此可见，GR在调节肝脏糖及脂肪代谢方面具有重要的作用，维持其正常表达水平有可能对改善肥胖、MS、糖尿病等代谢性疾病的糖脂代谢异常具有重要意义。

    目前，关于在肥胖、MS、糖尿病等代谢性疾病中GRα表达水平的研究并不多，研究结果尚存在争议。对于肥胖、MS、糖尿病等代谢性疾病中有高浓度游离脂肪酸已经达成共识，游离脂肪酸是否对GRα表达水平有影响尚不清楚。本研究通过高浓度游离棕榈酸刺激体外培养的正常肝细胞株L02，结果显示其GRα mRNA水平升高。研究发现，2型糖尿病动物模型db/db小鼠肝脏GRα在mRNA及蛋白质水平均明显高于db/+对照小鼠，并认为这与该动物模型的2型糖尿病表型相关[12]；并发现在体外，高浓度葡萄糖可刺激肝细胞GRα表达水平升高，还证实抑制肝脏GR表达有利于改善饮食引起的肥胖及胰岛素抵抗[12]，Zucker（fa/fa）大鼠肝脏GRα mRNA水平也明显升高[13]。然而，Brake等[14]研究显示高脂饮食3周及20周对大鼠肝脏GRα表达水平没有影响。

    本研究结果显示高浓度棕榈酸刺激体外培养的正常肝细胞株GR mRNA水平升高，但高脂饮食或高游离脂肪酸血症对肝脏GRα表达的影响需要进一步深入的研究。

【】
  [1]Liu YJ，Nakagawa,Y Wang Y,et al.Increased glucocorticoid receptor and 11beta?hydroxysteroid dehydrogenase type 1 expression in hepatocytes may contribute to the fiahenotype of type 2 diabetes in db／db mice[J]．Diabetes，2005(54)：32-40．

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