高效液相色谱法测定注射用辛芍中甘露醇含量

                作者：韩瑜 王永林 王爱民 兰燕宇 何迅 李勇军 黄勇

【关键词】  甘露醇 辛芍 色谱法 高压液相

注射用辛芍是由灯盏细辛和赤芍经提取加工制成的冻干粉针[1]，临床用于中风瘀血阻络证,能迅速改善脑缺血临床症状,对急性脑缺血、缺氧具有良好的治疗作用[2]。甘露醇是注射用辛芍的赋形剂（辅料），国内外对制剂中甘露醇含量的测定多为比色法或滴定法等，在实验操作和准确度上欠佳。本实验用高效液相色谱法（HPLC）测定注射用辛芍中甘露醇含量，该方法操作简便、快速灵敏、重现性好,可作为该制剂质量控制指标之一。

    1  材料与方法

    1.1  试药

    甘露醇对照品（药品生物制品检定所，批号100534?200301），乙腈（色谱纯）、重蒸水。注射用辛芍冻干粉针（贵阳医学院药物研究所，批号20040510，20040518，20040520）。

    1.2  仪器

    LC-10Avp高效液相色谱仪系列（岛津公司），含2台LC?10ATvp输液泵，岛津RID-6A示差折光检测器，7725i手动进样阀。WML色谱工作站（广西威玛龙色谱科技公司）。

    1.3  色谱条件

    [3～6]，采用Lichromsob?NH2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈?水（82∶18）为流动相，流速为1 ml/min，柱温为40 ℃。试验条件下各组分分离良好，理论塔板数按甘露醇峰计为4 300，阴性对照品溶液无干扰（图1）。图1  注射用辛芍供试品高效液相色谱结果

    Fig.1  HPLC chromatograms of Xinshao freeze dried injection sample 1.4  溶液的制备

    1.4.1  对照品溶液制备  精密称取甘露醇对照品200.5 mg，置25 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。

    1.4.2  供试品溶液制备  取供试品400 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

    1.4.3  阴性对照品溶液的制备  按注射用辛芍（冻干粉针）处方制备不含甘露醇的阴性对照品,按供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。

    2  结果

    2.1  线性关系考察

    精密吸取已制备好的对照品溶液1.5、2、2.5、3、3.5 ml于5个10 ml容量瓶中，分别加水稀释至刻度，摇匀，制得每1 ml分别含1.203、1.604、2.005、2.406、2.807 mg的系列对照品工作液。分别精密吸取上述系列对照品工作液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积(A)为纵坐标，进样浓度C（g/L）为横坐标，绘制工作曲线，用最小二乘法进行线性回归，得回归方程为A=446 501C?1 202 9，r=0.999 9，表明甘露醇进样浓度在1.2～2.8 g/L范围内与峰面积呈良好的线性关系。

    2.2  精密度试验

    2.2.1  重复性试验  取同一批号供试品制剂，按供试品溶液制备方法制备9份供试液，按拟定好的色谱条件进样测定，甘露醇平均含量为5.041%，RSD为1.8%。

    2.2.2  中间精密度试验  按成品中甘露醇供试品溶液制备方法制备3份供试品溶液，在不同日期、以不同分析人员分别测定，甘露醇含量平均值为5.050%，RSD为2.0%。

    2.3  稳定性试验

    取同一批号供试品，按1.4.2项下方法制备供试品溶液1份，分别于0、2、4、6、8 h进样，结果平均峰面积为884602，RSD为1.2%，供试品溶液在8 h内稳定。

    2.4  回收率试验

    采用加样回收率试验，精密称取已测定甘露醇含量的成品（含量5.041%）适量，精密加入甘露醇，按供试品溶液制备方法制备供试液，测定，甘露醇平均回收率为99.54%，RSD为2.4%，见表1。表1  回收率试验结果

    2.5  样品测定

    　　取成品制剂，按供试品溶液的制定方法制备供试品溶液及对照品溶液，分别进样20 μl，记录色谱，测定峰面积，甘露醇含量，3批样品测定结果为9.85 mg/支，10.2 mg/支，10.7 mg/支。

    3  讨论

    实验采用的甘露醇含量测定方法是根据药典2005版一部附录《中药质量标准分析方法验证指导原则》要求，通过对方法的专属性、线性、精密度（重复性、中间精密度）、准确度等试验考察 ,较原《中药新药质量标准研究的技术要求 》对含量测定方法学考察更为全面。

    在系统适用性试验中，甘露醇的保留时间约为16.5 min，阴性对照在甘露醇出峰位置处无干扰杂质峰，供试品中甘露醇与杂质峰分离度大于1.5，理论塔板数以甘露醇峰计算为4 300，故规定理论板数以甘露醇峰计算应不低于3 500。

    在线性关系考察试验中，拟合为过原点的方程为Y=440 947X，分别将最小进样浓度和最大进样浓度所得的峰面积代入公式计算甘露醇含量，结果相对偏差分别为0.6%和0.4%，说明该工作曲线几乎过原点，故采用外标一点法计算。

【】
  [1]王永林，黄勇，郑林，等.注射用辛芍冻干粉针药味配伍作用研究[J]. 中国实验方剂学杂志， 2007 (7):38-40.

[2]黄勇，王永林，兰燕宇，等.注射用辛芍对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用和对脑微循环血流量的影响[J].中国新药杂志，2008(2):119-123.

[3]余敏灵，罗静法.测定复方甘露醇注射液中葡萄糖和甘露醇的含量[J].中国药业，2003（9）:34-35.

[4]施燕支，郭雪清，余启荣，等.HPLC示差折光分析法测定口香糖中的木糖醇等多种糖醇的含量[J].首都师范大学学报(版)，2005(1):61-63.

[5]甘宾宾，马彦，叶志云.反相高效液相色谱法测定山梨醇和甘露醇[J].化学世界，1999(2):99-101.

[6]侯绪凤.重组人红细胞生成素制剂中甘露醇含量的测定[J].辽宁医药，2004(3):26-27.