糖尿病大鼠肾脏病变及其SnoN蛋白表达的变化

                作者：崔龙 刘瑞霞 李晓颖 石明隽 肖瑛 郭兵 张国忠 

【摘要】  目的： 复制2型糖尿病动物模型，并观察其肾脏病变及SnoN蛋白表达的变化。方法: SD大鼠随机分为正常对照组(NC)、高脂高糖组（HG）。高脂、高糖饮食12周后又随机分为高脂高糖对照组（HC）、糖尿病组（DM）。采用高脂、高糖饮食12周加小剂量链脲佐菌素注射( 30 mg/ kg )的方法复制2型糖尿病动物模型，成模大鼠随机分别于糖尿病8周（DM8）、12周（DM12）和16周（DM16）处死；Western印迹法检测肾皮质SnoN蛋白的水平；生物化学方法测血糖、血清胰岛素水平、甘油三酯、总胆固醇、血肌酐及24 h尿蛋白；光镜检查肾组织形态学改变。结果: DM组大鼠出现高血糖、高血脂、肾功能和肾组织形态学改变；HG组血清胰岛素水平、甘油三酯和总胆固醇明显升高，血糖与NC组相比差异无统计学意义；Western印迹检测发现DM8组肾组织中SnoN蛋白的表达明显低于NC组，且随病程进展逐渐减少，至DM16时减至NC组的64.20%。结论： 成功复制了2型糖尿病动物模型；SnoN蛋白的表达变化可能参与了2型糖尿病肾脏病变的发生、过程。

【关键词】  糖尿病，非胰岛素依赖型； 糖尿病肾病； 大鼠，Sprague-Dawley； 转录共抑制因子SnoN

    ［Abstract］ Objective: To establish type 2 diabetic rat model and observe its renal lesions and SnoN protein expression. Methods: Sprague-Dawley rats were divided into normal control, high-fat and high-sucrose groups. High-fat and high-sucrose groups were then divided into high-fat and high-sucrose controls and diabetes mellitus groups after taking high-fat and high-sucrose diet for 12 weeks. The diabetic rats were injected with low dose of streptozotocin (30 mg/kg) and were killed at the 20th, 24th, and 28th weeks respectively. The SnoN proteins in renal cortex were detected with Western blotting. Blood glucose, serum insulin concentration, trigly-ceride, total cholesterol, serum creatinine and 24 h urine protein were examined with biochemistry methods. The renal morphology on HE stained sections was checked with light microscope. Results: Diabetic rats showed hyperglycaemia, hyperlipemia, kidney morphological lesion and renal function changes. High-sucrose control group showed hyperinsulinemia and hyperlipemia, but the blood glucose was normal. Western blotting results showed that the expression of SnoN in diabetic renal tissues significantly decreased (P<0.01). Conclusions: Rat models of type 2 diabetes mellitus have been established successfully which can be used as a diabetic nephropathy model. The change of SnoN protein expression may play a role in the mechanisms of type 2 diabetic nephropathy. 

    ［Key words］ diabetes mellitus，non-insulin-dependent; diabetic nephrosis； rats,Sprague-Dawley；transcription co-repressor SnoN

    糖尿病是严重威胁人类健康的以高血糖为特征的代谢性疾病，其中2型糖尿病(T2DM)的发生在国外占整个糖尿病比例的85%~95%，国内报道则在90％以上[1]。但目前国内糖尿病的研究多采用大剂量链脲佐菌素（streptozoticin,STZ）诱导的1型糖尿病模型，国外对2型糖尿病的研究亦大多采用价格昂贵的自发性动物模型，并且其特点是遗传因素在发病过程中占主导地位，与临床上的发病特征不完全吻合。而对于膳食加小剂量STZ注射诱导的与临床发病过程相近的2型糖尿病模型的复制方法，目前尚无统一的标准[2]。引起糖尿病患者死亡的主要原因是其血管并发症，而糖尿病肾病即是其常见的微血管并发症之一。以往的研究发现核转录共抑制因子SnoN蛋白的表达变化与STZ诱导的糖尿病大鼠肾病的发生、发展过程密切相关[3]。2007年8月~2008年8月采用高脂、高糖饮食加小剂量STZ腹腔注射的方法，通过调整饮食结构和饲喂时间探讨2型糖尿病模型的复制，并对其发病过程中肾脏病变及SnoN蛋白的表达变化进行观察。  

     1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物和试剂  Sprague-Dawley （SD）大鼠30只, 雄性，体重（200±20）g,由贵阳医学院实验动物中心提供。STZ购于美国Sigma公司；SnoN抗体购于美国Santa Cruz公司；β-actin单克隆抗体及DAB显色剂和辣根过氧化物酶标记的二抗购于武汉Boster公司；Western印迹用PVDF膜，3 mm Whatman滤纸购于美国milli-pore公司；胆固醇购于北京双旋微生物培养基制品厂；胰岛素测定试剂盒购自天津九鼎生物医学工程有限公司；TG和TC测定试剂盒购自四川迈克有限公司；考马斯亮蓝测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

    1.1.2  主要器材  日本京都血糖仪；高速低温离心机（美国Beckman公司）；核酸蛋白分析仪（美国Amersham公司）；电泳系统及电转移装置（美国Amersham公司）；凝胶成像系统（美国Bio-RAD公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  动物分组  将SD大鼠随机分成正常对照组(NC，n=6)、高脂高糖组（HG，n=24）。高脂高糖组喂养12周后又随机分为高脂高糖对照组（HC，n=6）、糖尿病组（DM，n=18）。成模大鼠随机分别于糖尿病8周（DM8，n=6）、12周（DM12，n=6）和16周（DM16，n=6）处死。NC组以常规饲料喂养，各组大鼠均自由饮水。

    1.2.2  饮食诱导胰岛素水平升高  大鼠适应性饲养1周后，HG组以高脂、高糖饲料喂养，饲料组成如下：67%常规饲料、20%蔗糖、10%猪油、2%胆固醇、1%蛋黄。喂养12周时，称体重，测空腹血糖，尾动脉取血测血清胰岛素水平。

    1.2.3  小剂量STZ注射诱导糖尿病  高脂、高糖饮食12周后,DM组大鼠按30 mg/kg剂量腹腔注射STZ (以pH4.5、0.01 mol/L无菌枸橼酸缓冲液配成1%浓度)。72 h后测空腹血糖，血糖值≥13.8 mmol/L者作为2型糖尿病大鼠，18只大鼠全部建模成功。

    1.2.4  动物标本的采集  分别于试验的第20周、24周和28周时处死DM8、DM12和DM16各组大鼠，于28周时一并处死NC和HC组大鼠。处死前代谢笼留24 h尿液，称体重，股动脉取血；开腹取肾脏，称肾重，一侧肾脏固定于4%多聚甲醛，另一肾脏于-80 ℃保存供Western印迹检测。

    1.2.5  生化检测  氧化酶（GOD-PAP）法测血清葡萄糖；放免法测血清胰岛素水平；考马斯亮蓝法测尿蛋白浓度，尿蛋白浓度与24 h尿量的乘积为24 h尿蛋白量；血甘油三酯和胆固醇测定均按试剂说明书操作。

    1.2.6  肾组织形态学观察  多聚甲醛固定的肾脏组织行石蜡切片，经HE染色后光镜观察肾组织形态学改变。

    1.2.7  Western印迹检测  取-80 ℃保存的各组大鼠肾皮质，每组100 mg，分别加入组织蛋白提取液后匀浆、离心、取上清，考马斯亮蓝法测定各组蛋白质浓度，每个样品上样150 μg，按所测得浓度各样品所需体积，加入2倍上样缓冲液煮沸10 min。经12%的SDS-PAGE凝胶电泳分离，再转移至PVDF膜上，脱脂奶粉室温封闭1 h，加入SnoN或β-actin一抗，工作浓度均为1∶100，4 ℃孵育过夜。复温45 min，TBST洗膜后，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（浓度均为1∶5 000）室温孵育2 h，加DAB显色液显色。凝胶成像系统进行图像分析，用Quantity one软件分析蛋白条带，测定各条带的面积和灰度值，二者乘积为积分灰度值，以SnoN与β-actin的积分灰度值比值为SnoN蛋白相对值，取3次重复测定值之均数。

    1.2.8  数据分析  所有数据以x±s表示，采用SPSS11.5软件处理，两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。

    2  结果

    2.1  高脂、高糖饮食对各组大鼠体重、血糖及血清胰岛素的影响

    高脂、高糖饮食12周时，与NC组相比，HG组大鼠体重及血清胰岛素水平显著增加(P<0.01)；空腹血糖与NC组相比差异无显著性（P>0.05），见表1。表1  饮食对各组大鼠体重、血糖及胰岛素的影响(1)与正常对照组相比，P<0.01

    2.2  小剂量STZ注射后对各组大鼠血糖、血清胰岛素、血清甘油三酯及胆固醇的影响

    注射STZ后8、12及16周，DM各组空腹血糖均明显高于未注射的28周的NC组和HC组，差异有显著性（P<0.01）；血清胰岛素较注射STZ前明显下降且显著低于HC组(P<0.01)，但与NC组相比差异无显著性。DM组各组血清甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）均显著高于NC组(P<0.01)，且随病程进展而升高，至DM12和DM16时显著高于HC组(P<0.01)。见表2。

    2.3  血肌酐、24 h尿蛋白及肾脏指数

    　　大鼠在注射STZ后8周，血肌酐（Scr）、24 h尿蛋白（24 h urine protein,24UP）及肾脏指数（kidney index,KI）均显著高于NC组和HC组（P<0.01），且随病程进展逐渐升高。HC组与NC组相比血肌酐、24 h尿蛋白及肾脏指数差异均无显著性，见表3。

    2.4  肾组织形态学变化

    HE染色下见正常组肾小球形态完整、轮廓清晰；肾小管未见异常。DM16组肾小球体积增大和表2  不同时点糖尿病组的血糖、胰岛素、甘油三脂及胆固醇表3  各组大鼠血肌酐、24 h尿蛋白及肾脏指数的变化系膜基质增生；肾小管管腔扩张，上皮细胞脱落，部分肾小管基底膜不完整，间质可见炎细胞浸润。见图1。

    2.5  Western免疫印迹结果

    NC组和HC组大鼠SnoN表达较多，SnoN与β-actin的积分灰度值之比分别为0.81±0.06和0.94±0.16，两组间差异无统计学意义。DM8组为0.63±0.05，与NC组相比显著减少，随着DM的进展SnoN的表达逐渐减弱，至DM16组时减少为正常组的64.20%（0.52±0.11）。见图2。

    3  讨论

    2型糖尿病是由于胰岛素抵抗和胰岛素分泌障碍两方面缺陷引起的。其中胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要始发因素，贯穿于2型糖尿病的发生、整个过程。胰岛素抵抗发生后，只要胰腺能维持足够的胰岛素分泌量来克服胰岛素抵抗，那么糖耐量将保持正常或只有轻微受损。而一旦β细胞功能开始下降，糖耐量将迅速降低，并发展成糖尿病。 目前，国内外2型糖尿病模型的复制多数即根据此原理，先通过高脂、高糖饮食诱导出胰岛素抵抗，再用小剂量STZ损伤胰岛，使胰岛素的分泌减少，进而复制出与临床2型糖尿病发病过程相似的动物模型。但有关高脂、高糖饲料的配方及饲喂时间尚无统一的标准，为此，本研究国内外报道的方法并通过调整高脂、高糖配方和延长饲喂时间复制2型糖尿病大鼠模型[4~8]。

    本实验中，饲喂高脂、高糖饲料12周时大鼠体重显著高于正常对照组，且血清胰岛素水平显著升高，但血糖与正常组相比无差异。也就是说，高脂、高糖饮食12周诱导出了高胰岛素血症和胰岛素抵抗。高脂、高糖饮食诱发胰岛素抵抗的机制可能是由于血清甘油三酯（TG）和游离脂肪酸（FFA）水平增高，FFA通过糖脂肪酸循环、胰岛素信号转导等多个不同途径抑制糖储存，降低胰岛素敏感性，而导致胰岛素抵抗的发生[9]。大鼠出现胰岛素抵抗后，再通过注射小剂量STZ(30 mg/kg体重)损伤胰腺功能，导致胰腺代偿性分泌胰岛素的功能障碍，最后诱发高血糖。注射STZ后大鼠胰岛素水平与同期高脂高糖组相比显著降低，与正常对照组相比差异无统计学意义，说明STZ引起胰岛部分破坏，减少了胰岛素的代偿性分泌。整个实验过程中，成模组大鼠血糖持续在高水平，血清甘油三酯和胆固醇代谢水平亦在不断升高，表明本实验的造模方法稳定且与临床2型糖尿病的慢性发病过程相似。

    　　糖尿病肾病是糖尿病常见的微血管并发症，主要表现为肾脏肥大，持续性蛋白尿和进行性肾功能衰竭等[10]。本实验高脂高糖组大鼠各项肾脏指标与正常组相比差异均无显著，糖尿病成模8周时即出现肾脏指数、24 h尿蛋白量和血肌酐显著升高，且随病程进展持续增加，说明肾脏出现肥大且其滤过功能受损。形态学观察发现糖尿病大鼠肾小球体积增大，肾小管管腔扩张，上皮细胞脱落，间质可见炎细胞浸润，说明DM大鼠发生了糖尿病肾病。因此，本实验动物模型可以作为糖尿病肾病模型进行研究。

    　　SnoN蛋白是TGF-β1/Smads信号通路中重要的核转录抑制因子[11,12]。本课题组以往的研究显示，该信号通路在单纯STZ注射复制的1型糖尿病模型肾脏病变的发生、发展中起重要的作用，且SnoN蛋白的表达变化与糖尿病肾病的发生、发展密切相关[3]。本研究结果显示，单纯的高脂高糖组肾组织中SnoN蛋白的表达与正常组相比差异无显著性。在高脂高糖饮食基础上注射STZ复制成2型糖尿病时，随病程进展SnoN蛋白持续减少，成模16周时减少为正常组的64.20%。本课题组在对1型糖尿病的研究发现，糖尿病8周时SnoN蛋白已减少为正常组的42%，这可能与2型糖尿病病变发展缓慢有关。而有关SnoN蛋白在2型糖尿病发生、发展中变化的意义及其与其它信号分子的相互作用关系，有待进一步研究。

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