麦芽醇对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响

                作者：周慧芬，刁路明，甘云波，李云

【摘要】  目的 观察麦芽醇对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后神经元型NOS（nNOS）的影响。方法 建立大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）再灌流模型，应用免疫组织化学方法检测脑组织中nNOS的表达。结果 脑缺血再灌注损伤后，脑组织中nNOS表达明显增强，给予麦芽醇后，nNOS表达减弱。结论 麦芽醇可抑制nNOS表达，对脑缺血再灌注损伤有保护作用。

【关键词】  麦芽醇；脑缺血再灌注；一氧化氮合酶

    ABSTRACT: Objective   To investigate the effect of maltol on the expression of nNOS after focal cerebral ischemia/reperfusion in rats.  Methods  The model of ischemia/reperfusion injury was established by temporary middle cerebral artery occlusion (MCAO). The expression of nNOS was analyzed by immunohistochemistry. Results  The expression of nNOS was increased significantly after cerebral ischemia/reperfusion. Application of maltol could inhibit the expression of nNOS.  Conclusion  Maltol has a protectetive effect on cerebral ischemia/ reperfusioninjury by reducing the expression of nNOS.

    KEY WORDS: Maltol;Cerebral ischemia reperfusion;NOS

    目前已经确定的一氧化氮合酶的亚型有3种，分别称为神经元型NOS(neuronal NOS,nNOS),诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)和内皮型NOS(endotheial NOS,eNOS)。脑缺血再灌注损伤后NOS活性明显增加，加重局灶性脑缺血损伤[1]。麦芽醇是从红参中提取的单体化合物，其在体内外可与自由基结合，对脑缺血再灌注损伤有保护作用[2,3]。为了深入研究麦芽醇抗脑缺血的机制，本文观察了麦芽醇对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后神经元型NOS的影响。

    1  材料与方法

    1.1  试验动物和分组

    成年健康雄性SD大鼠36只，体质量230～280g，清洁级，咸宁学院医学院试验动物中心提供。随机分为对照组、缺血再灌注组和麦芽醇组，每组12只。

    1.2  大脑中动脉闭塞（MCAO）再灌注模型的建立

    参照Koizumi等[4]方法制作大鼠左侧大脑中动脉阻塞及再灌流模型。采用10％水合氯醛（0.3ml/100g）麻醉,术中维持动物肛温(36.6±0.5)℃，颈部正中切口，分离并结扎左侧颈总动脉、颈外动脉, 注意避免刺激迷走神经。从颈总动脉分叉处插入4.0 丝线,沿颈内动脉进入距颈总动脉分叉处1.8～2.0 cm略感阻力时停止；30min后拔出丝线进行缺血再灌流。术后在约20℃的空调环境下单笼饲养,自由进食、进水。对照组只暴露血管。

    1.3  给药方法

    有关[4]麦芽醇组分别在缺血前和缺血后30min经尾静脉注射2ml 700μmol/L麦芽醇生理盐水。

    1.4  免疫组化检测nNOS的表达

    大鼠在脑缺血30min再灌注24h后经水合氯醛腹腔麻醉，开胸经主动脉插管，剪开右心房，以200ml生理盐水经升主动脉快速冲洗。随后灌注冷的(4℃)4%多聚甲醛固定液350ml，开颅取出全脑，修块保留缺血中心区(前囟后1.8mm)后固定于相同固定液中6h，入25%蔗糖至组织块下沉。AO恒冷箱切片机连续冠状切片，片厚20μm。对脑组织冰冻切片进行nNOS表达的检测，蒸馏水新鲜配置3%H2O2，室温浸泡5～10min以灭活内源性酶，滴加正常山羊血清30 min，不洗，甩去多余液体；滴加兔抗鼠nNOS一抗(1∶400，北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温下(25℃)孵育2h，然后在4℃下过夜，PBS洗；滴加生物素化山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司二抗试剂盒)，室温下30min，PBS洗；滴加辣根酶标记的链酶卵白素稀释液,室温孵育45min，PBS洗10min×3次；DAB显色，室温下15min，双蒸水多次洗涤；脱水、透明，中性树胶封片。显微镜下观察，阳性细胞呈棕黄色颗粒。

    1.5  图像分析和统计处理

    每组动物取10张切片，每张切片选取左右皮层，用HPIAS?100高清晰度彩色图文分析系统对其免疫反应产物进行吸光度测定。所得实验数据输入机用SPAS软件进行统计处理，结果以均数±标准差（±s）表示，并以方差分析，以P<0.05为差异有显著性意义。

    2  结  果

    nNOS免疫反应反应产物为棕褐色颗粒或点状，分布于胞浆。缺血再灌注组nNOS在皮层大量表达，与正常对照组相比染色明显加深。麦芽醇组nNOS在皮层阳性表达与缺血再灌注组比较染色明显减弱（图1）。对各组大鼠皮层经HPIAS?100高清晰度彩色病理图文分析系统测定其吸光度，并经包于该系统内的统计软件处理（方差分析），定量分析结果显示缺血再灌注组nNOS在皮层的吸光度（9.25±0.22）较正常对照组（7.66±0.32）相同脑区显著上升(P<0.05)；麦芽醇组在皮层吸光度（7.66±0.32）较缺血再灌注组显著降低(P<0.05)。

    3   讨  论

    NO是一种自由性质的气体，为较小的生物活性分子，可自由穿过细胞膜，作用于细胞内的靶分子。机体内NO过量的生成可直接抑制有关酶的活性,可与超氧化物歧化物结合导致细胞的损伤[5 ,6 ]。有研究表明NO在脑缺血性损伤的发病中起重要作用，缺血后数分钟NO含量明显增高,之后缓慢下降，于再灌注期NO再次升高[7]。NOS是NO合成中的关健调节因素，体内NO的含量及生物学作用完全依赖于NOS的活性。NOS活性的升高伴随着NO含量的增加。在3种NOS中nNOS和eNOS在缺血再灌注早期发挥作用，iNOS在缺血再灌注晚期发挥作用，参与神经损伤。NOS活性升高和NO含量增加的机制可能为：脑缺血后神经元受损，细胞膜去极化过程增强，突触前谷氨酸等兴奋性氨基酸生成大量增加，使细胞外谷氨酸浓度升高，激活N?甲基?D?天门冬氨酸(NMDA)受体，NMDA受体激活后使突触后Ca2+内流增加，激活NOS活性，促进NO的生成；再次，脑缺血后，ATP大量消耗，使能量代谢障碍及cAMP依赖性蛋白激酶活性下降，使NOS脱磷酸化，NOS的活性增强。本实验的研究结果表明，大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后，脑组织中nNOS活性显著增加，说明nNOS参与了脑缺血再灌注损伤的发病机制，给予麦芽醇后，nNOS活性明显下降。本研究结果表明麦芽醇对脑缺血再灌注损伤的保护作用与其对nNOS的调节有关，我们推测麦芽醇对另外两种NOS也进行调节，麦芽醇通过对NOS活性和NO含量进行调节从而发挥脑缺血再灌注损伤的保护作用，详细机制有待进一步研究。

【】
  [1]Deng Q,Xu J,Zhu D.Inducible nitric oxide synthase and upper phase of focal verebral ischemia[J].Life Sciences,1999,11(3):102

[2]高艳，戴冀斌，李应续.麦芽醇对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡的影响[J].咸宁学院学报(医学版),2007,21(01):4

[3]甘云波,胡松林,王亚威.麦芽醇治疗大鼠不完全性脑缺血再灌注损伤的实验研究[J].咸宁医学院学报,2001,15(01):14

[4]Koizumi J,Yoshida Y,Nakazawa T,et al.Experimental studies of ischemic brain edema:a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemia area[J].Jpn J Stroke,1986,8:1

[5]Backman JS.The Double?edged Role of Oxide in Brain Function and Superoxide?mediated Injury[J].J Dev Physiol,1991,(15):53

[6]Caldmell M,O Neill M,Earley B,et al.NG?Nitro?L?ar?ginine Protects Against Ischemia?induced Increases in Nitric Oxide and Hippocampal Neuro?degeneration in the Gerbil[J].J Pharmacol,1994,260(2):191

[7]马玉羡.脑缺血再灌注损伤病理生理机制研究进展[Ｊ].河南医学研究,1998,7(4):375