改良混合酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞

                   作者：李成武，李应续，朱从丽，宋健

【摘要】  目的 探讨改良酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMC）的方法，为动脉粥样硬化等血管硬化性疾病的发病机制和防治研究提供帮助。 方法 提取大鼠的胸主动脉，采用混合酶消化后，采用含10%FCS RPMI1640培养基培养。通过细胞计数观察细胞增殖，倒置相差显微镜观察血管平滑肌细胞的生物学性状，免疫组织化学进行细胞鉴定。结果 消化肌平滑肌细胞24h后贴壁，平均贴壁率为76%，第5 d后细胞数迅速增加，至第11 d形成单层时，光镜下出现“峰?谷”样生长；传代后，细胞的生长特性无改变，α?SMA免疫组化染色检测，证实细胞是VSMC。结论 改良后酶消化法能短时、高效地培养生物学特征稳定的VSMC。

【关键词】  酶消化法;平滑肌细胞;胸主动脉;SD大鼠

    ABSTRACT:Objective  To explore the cultivation of rat vascular smooth muscle cells (VSMC) by enzymatic dispersion which helps to provide ideals for the prevention and treatment of angiosclerotic diseases. Methods  The thoracic artery was immediately removed and cut into fine tissue pieces, then was incubated in a mixed medium.After digestion,the cells were cultured in RPMI1640 with 20% FCS and then plated onto plastic tissue culture dishes.The proliferation of cell was assayed by cell counting,the feature of vascular smooth muscle cells was observed with inverted phase contrast microscope,and immunohistochemical method was used to indentify cells.Results  After 24h of incubation,VSMCs began to stick to the wall of the incubation dishes,and the adherent rate was 76% .After 5th day,the cell number was increased rapidly,and they form  monolayer on 11th day.A "the peak ?valley" type of growth could be observed by light microscope.After passages, the growth characteristics of cells did not changed,and the confirmation cell was VSMC by α?SMA immunohistochemical testing.Conclusion  The improved enzymatic dispersion method for VSMC can increase the cell stability of biological characteristics with short?time.

    KEY WORDS:Enzymatic dispersion;Vascular smooth muscle cell;Thoracic aortat;Sprague?Dawley rat

    动脉平滑肌细胞（VSMC）的培养是研究平滑肌细胞分子生物学的有效手段，尤其可为平滑肌细胞的增殖、迁移相关的心血管疾病的病因、机理研究提供良好的实验模型。目前，国内、外介绍平滑肌细胞的培养主要是组织贴块法和酶消化法。具体的操作各不相同,各有优、缺点。本文介绍本实验室通过改良酶消化法，采用胶原酶、弹性酶和脱氧核糖核酸酶消化主动脉平滑肌细胞，探讨大鼠VSMC原代培养的新方法。

    1  材料与方法

    1.1  主要试剂与动物

    雌性成年Sprague?Dawley大鼠（体质量160～180g  SPF）由武汉大学动物实验中心提供。 胶原酶Ⅱ型（BY60619 Sigma）；弹性蛋白酶（E7885，Sigma）；脱氧核糖核酸酶Ⅰ型（D5025, Sigma）；α?平滑肌肌动蛋白抗体（BM0002  Boster）; 胎牛血清（16000044，Gibco）；FITC标记的羊抗鼠IgG免疫荧光二抗。

    1.2  主要溶液

    ①D?Hank's液（g／L）：KCl 0.4g， KH2PO4  0.06g， NaCl  8g， NaHCO3  0.35g， Na2HPO4  0.0318g；②RPMI1640培养基（含10%FCS）：培养粉1.04g，双抗2ml，谷氨酰胺4ml， FCS 10ml ，加双蒸水至100ml ；③0.4%胶原酶；④0.1%弹性蛋白酶；⑤0.1%脱氧核糖核酸酶Ⅰ型。

    1.3  原代培养

    ①取雌性SD大鼠（体质量约180±20g）断髓处死，活力碘进行皮毛消毒，无菌条件下快速分离胸主动脉，并置于D?Hank's平衡盐液中；②冰上操作：D?Hank's洗涤3次，清除血管表面的脂肪和结缔组织；眼科剪纵向剪开血管，用无菌棉签擦血管内膜2～3次；钟表镊剥离血管中膜内2/3的平滑肌组织，并收集于不含血清的RPMI 1640培养基中；③ 弃去组织块中的培养基，加入3倍组织块体积的新鲜配制的酶混合液（含0.4％胶原酶、0.1%弹性蛋白酶和0.1%、0.1%脱氧核糖核酸酶Ⅰ型），37 ℃恒温水平摇床中震荡54rpm，消化30min后，每隔10min用吸管轻柔快速吹打一次，镜下观察组织消化，消化约1.5h后，镜下观察约90％以上组织成细胞悬液。用含10% FCS的RPMI?1640培养基终止消化；④ 将酶混合物收集于离心管中，1000rpm×5min离心，弃去上清液；⑤细胞接种于含10% FCS，100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的无酚红RPMI 1640培养基中，调整密度约5×105/ml，在37℃，5% CO2环境下培养。

    1.4  VSMC增殖的观察

    按上述条件培养的VSMC以3×105 个细胞/孔密度种植于6孔板中；分别于第1、3、5、7、11、13 d (更换培养基后)，按我们以前描述的方法[1]收集细胞、平均细胞数/孔，并绘制VSMC生长曲线。

    1.5  细胞鉴定

    ①倒置相差显微镜下观察平滑肌细胞的形态和生长特性。②免疫组织化学鉴定：传一代时，取接种有细胞的无菌盖玻片，4%多聚甲醛室温下固定30min，PBS冲洗2～3遍后，置于30%H2O2?纯乙醇（30%H2O2∶纯乙醇=1∶50）溶液中室温下浸泡30min。蒸馏水冲洗3次，PBS冲洗1次后，加α?平滑肌肌动蛋白（α?SMA 1∶250）在37℃孵育2h； PBS冲洗，加FITC标记的羊抗鼠IgG免疫荧光二抗（1∶500）37℃避光孵育1h后，PBS冲洗，显微镜下，任取6个视野计数，计数抗α?SMA染色阳性细胞数（VSMC胞胞浆中出现细丝状棕褐色免疫反应产物为阳性）和总细胞数，计数阳性百分率的平均值为培养SVMC的纯度。

    2   结  果

    2.1  原代培养VSMC形态学观察

    消化下来的细胞呈圆形或椭圆，培养24h后，细胞贴壁良好，76%的贴壁形态呈树枝状，48h后细胞开始伸展，呈梭形，但数量几乎没有改变。第5d后，进入对数增殖，大量细胞完全伸展，开始发生融合（图1），形成典型的长梭状。第11d后形成单层，出现“峰?谷”样生长（图2）。

    2.2  原代培养VSMC的增殖

    新鲜分离的VSMC在原代培养的第1d细胞计数为 2.31±0.27×105/孔,平均贴壁率为76%。第3到第5d，细胞计数无显著性变化。第5d后细胞数迅速增加，第7d时增至(4.65±0.29)×105/孔(P<0.05), 第9d时增至(6.01±0.27)×105/孔，至第11 d形成单层时达7.84±0.31×105/孔，此后增殖趋于停止。

    2.3  原代培养VSMC免疫组织化学鉴定

    传一代的细胞经特异性的抗α?SMA染色后，胞质着色显示，>95%的细胞呈阳性反应（图3）。阳性细胞胞浆中有大量与细胞长轴平行的细丝状棕褐色免疫反应产物（图4）。

    3  讨  论

    VSMC是血管中膜内唯一类型的细胞。SMC的增殖，向内皮下层迁移、并在内皮下层增生和合成大量细胞外间质以及凋亡，导致动脉内膜增厚(intima thickening)或新内膜 (neointima)形成，是动脉粥样硬化早期以及冠脉气囊扩张术后再狭窄形成过程中的一个重要病理特征。因此，稳定、良好的细胞体外培养对观察VSMC在各种相关疾病中生物学行为的变化，研究其在疾病发生的病理过程中的影响具有重要的意义。

    目前国内、外血管平滑肌常用贴块法和酶消化法这两种方法[2，3]。贴块法具有操作简单、，获取的细胞纯度高的优点；然而细胞培养周期长，表型专一，主要获取合成型细胞，表现为肌丝少，与蛋白质合成相关的细胞器多，细胞的生物学性状发生改变。传统的酶消化法解离细胞迅速、充分，保持细胞生物学性状较好；但操作繁琐，酶对细胞损伤大，难以把握操作过程，我们Yi. Guan和Campbell的方法[4，5],反复实践，作如下改进：①通过棉签机械除内膜，联合眼科镊撕中膜的方法，减少了对细胞的机械损伤，同时提高了细胞纯度；②降低酶的浓度，减少了实验成本。0.5％胶原酶改为0.4％；0.5％的弹性酶改为0.1％，去掉胰酶抑制剂，增加0.1%脱氧核糖核酸酶Ⅰ型。③在消化的过程中，采用在水平摇床低速（54rpm）、恒温（37℃），既保证了酶的高活性和浓度的均匀，又避免了震荡时对细胞的机械损伤。而实验的结果证明培养细胞的时间缩短（消化2h后可接种培养）；消化后的细胞状态好，数量多，24h后平均贴壁率达76%，没有降低效果。

    本操作方法简单，易于掌握，获取的细胞数量多，活性高。但是在具体的操作过程中，应注意一些细节问题：在取材时，动作轻柔、迅速，尽量在冰上操作，保证取材组织的活性，严格控制消化时间；消化30min后，随时观察组织的消化状况和细胞的状态，既避免了酶对细胞的过度损伤，同时又保证了消化细胞的数量和质量；在消化吹打时，应高频低幅地吹打，力度以组织块刚好吹散为佳，每次吹打尽量保持一致，保证实验条件的一致性。通过应用改良的酶消化法，分离、提取和培养了高纯度的原代大鼠主动脉平滑肌细胞，为与平滑肌细胞相关的增殖性心血管疾病的研究提供了坚实的基础。

【参考】
  [1]Song J, Wan Y, Rolfe BE, et al. Effects of estrogen on vascular smoothmuscle cells is dependent upon cellular phenotype [J].Atherosclerosis, 1998, 140(1): 97

[2]司徒镇强，吴军正．细胞培养[M].西安：世界图书出版公司，1996：107

[3]鄂征.组织培养和分子细胞学技术[M].北京:北京出版社，1995：153

[4]Yi. Guan Y Y. Culture of cerebral artery smooth muscle cells[J].J Sun Yat?sen Univ(Med Sci)，2001，22(5),400

[5] Chamley?Campbell JH,Campbell GR,Ross.The smooth muscle cell in culture[J].Physiol Rev，1979,59(1):1