CXCL12促进人胃癌AGS细胞体外侵袭及其机制研究

【摘要】  目的 研究趋化因子CXCL12 对人胃癌AGS 细胞侵袭性的影响。方法 在体外用不同浓度CXCL12 处理AGS 细胞后，应用Transwell侵袭实验、RT?PCR、明胶酶谱分析法、ELISA法，观察CXCL12对肿瘤体外侵袭能力及金属基质蛋白酶MMP?9活性和VEGF表达的影响。结果 CXCL12作用后，人胃癌AGS细胞侵袭能力明显增强，并具一定的量效关系；金属基质蛋白酶MMP?9活性呈剂量依赖性增强，VEGF的分泌增加。结论 CXCL12在体外可增加人胃癌AGS 细胞的体外侵袭性。

【关键词】  趋化因子；CXCL12；胃癌；胃黏膜上皮细胞；金属基质蛋白酶9

    ABSTRACT：Objective To study the effects of CXCL12 on the invasion of the human gastric carcinoma cell (AGS cell). Methods  AGS cells were pretreated with different concentrations of CXCL12 in vitro, and cell migration assay, RT?PCR, zymography and ELISA were used to observed the effects of CXCL12 on motility, invasion and MMP?9 activity and mRNA expression of AGS cells. Results  CXCL12 could increase invasion ability of AGS cell in vitro. The activity of MMP?9 was increased in a dose?dependent manner. The mRNA expression of MMP?9 of pretreated AGS cells was up?regulated. Conclusion  CXCL12 could increase invasion ability of human gastric carcinoma cells in vitro.

    KEY WORDS：Chemokine;CXCL12;Gastric cancer;AGS cells；MMP?9

    肿瘤的侵袭是肿瘤转移的重要环节，是肿瘤细胞粘附、酶降解基质、移动、基质内增殖等一系列过程的表现[1]。本研究体外观察了趋化因子CXCL12对肿瘤体外基质金属蛋白酶MMP?9活性以及VEGF表达的影响，以探讨CXCL12促进胃癌细胞侵袭转移的作用机制。

    1  材料和方法

    1．1  实验材料

    CXCL12购自美国Sigma公司；胰蛋白酶和DMEM培养基(高糖)购自Gibco公司(USA)；胎牛血清购自杭州四季青公司(CHINA)；Trizol Reagent购自TaKaRa公司(JAPAN)；M?MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)、dNTP混合物购自Promega公司(USA)；引物序列由上海Invitrogen公司(USA)合成；Transwell侵袭小室购自Costar公司(USA)；人工基质胶(Matrigel)购自BD公司(SPAIN)。

    1．2  实验方法

    1．2．1  细胞培养

    人胃癌AGS细胞购自武汉大学细胞典藏中心(CTCC)。AGS细胞贴壁培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基，37°C、5%CO2饱和湿度条件下培养。取对数生长期细胞进行实验。按如下分组进行实验：空白对照组、50ng/mlCXCL12组和100ng/mlCXCL12组，每组设置3个平行孔。

    1．2．2  Transwell侵袭小室检测细胞侵袭能力的变化

    侵袭能力的测定采用Transwell侵袭小室：Matrigel胶(30μg/孔)包被聚碳酸酯膜(8μm孔径)内表面，以此膜分隔上、下小室。无血清DMEM调整细胞浓度为1×106/ml，在上室中加入100μl细胞悬液，在下室中加入600μl含不同浓度CXCL12的无血清培养液，然后在37°C的培养箱中孵育48h，取出滤膜，用4%的多聚甲醛固定，棉签擦去滤膜上未贴壁的细胞，甲醛固定5min，HE染色。400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力。随机计数5个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数3份样本。

    1．2．3  RNA提取和逆转录?聚合酶链反应(RT?PCR)

    RNA提取参照RNA Trizol提取试剂盒的操作说明书进行。提取的RNA纯度由A260/A280比值和1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取1μg RNA，以Oligo dT为引物逆转录成cDNA。反应体系(20μl)：5×M?MLV buffer 4μl，dNTP 10mmol，RNase 20U，M?MLV 100U，Oligo dT 20pmol，RNA 1μg。逆转录反应条件：20°C 10min，42°C 60min，95°C 5min。取2μl的逆转录产物行PCR扩增，以β?actin作为内参照。MMP?9引物：上游5′?ATCCAGTTTGGTGTCGCGGAGC?3′，下游5′?GAAGGGGAAGACGCACAGCT?3′；β?actin引物：上游5′?CCTGGCACCCAGCACAAT?3′,下游5′?GCCGATCCACACGGAGTACT?3′。PCR反应条件：95°C 5min，94°C 60s，57°C 45s，72°C 60s，35个循环；72°C 10min。2%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统扫描对PCR产物进行半定量分析，分析结果时以β?actin的产物为内对照，MMP?9/β?actin比值。

    1．2．4  明胶酶谱法分析CXCL12对基质金属蛋白酶（MMP）活性的影响

    将对数生长期细胞接种6孔培养板，37°C、5%CO2培养24h后，改换含不同浓度CXCL12的无血清培养液培养；继续培养24h后，收集上清液，离心处理后上清液作为测定的样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。制备10%分离胶(含0.1%明胶)，5%浓缩胶；样品与缓冲液按2∶1混匀、加样；10mA恒流、4°C电泳至分离胶时换成15mA恒流；至溴酚蓝刚好到胶底处，停止电泳。分离胶用蒸馏水漂洗2次后加酶缓冲液，置37°C摇床摇36h；水洗，染色、脱色，观察透明带，用凝胶成像仪和LABWOR软件读取透明带并进行定量分析。

    1．2．5  酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中VEGF含量

    收集各组细胞培养上清，置于-20°C保存待测。ELISA按试剂盒说明书进行操作。根据试剂盒提供的标准品制作标准曲线。每孔加入100μl细胞培养上清液，让待测抗原与包被的抗体结合，37°C孵育60min。洗板4次，每孔加入100μl生物素标记抗体，37°C孵育60min。洗板4次，每孔加入辣根过氧化酶标亲合素100μl，37°C孵育40min。洗板4次，每孔加入显色剂100μl，37°C避光显色20min。在490nm波长检测吸光度(A)值，通过绘制的标准曲线求出待测样本中VEGF浓度(pg/ml)。

    1.3  统计学分析

    所有数据均以±s表示，采用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2．1  CXCL12对AGS细胞侵袭能力的影响

    我们采用Transwell侵袭小室法检测了AGS细胞侵袭能力的变化，结果发现：CXCL12可明显增强AGS细胞的侵袭力。每200倍视野计数，空白对照组的穿透数为(46±5)个，50ng/ml和100ng/ml CXCL12 处理组AGS细胞的穿透数分别为(93±6)个和(115±9)个。统计学分析表明，50ng/ml组和100ng/ml组与空白对照组间差异有统计学意义(P均<0.05)，表明CXCL12能显著增强胃癌细胞的体外侵袭能力。

    2．2  CXCL12对AGS细胞MMP?9 mRNA表达的影响

    PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示：各实验组均可检测到特异性的MMP?9mRNA的基因条带；CXCL12可以上调AGS细胞中MMP?9mRNA的表达水平，结果见图1。半定量分析结果显示，空白对照组中MMP?9/β?action比值为(34.2±5.6)%；50、100ng/ml CXCL12处理后，MMP?9/β?action比值分别为(52.8±6.3)%、(67.5±8.4)%，其表达明显增强，经统计学分析，差异有统计学意义(P均<0.05)。

    图1  CXCL12对AGS细胞MMP?9 mRNA

    表达的影响

    2．3  CXCL12对AGS细胞MMP?9活性的影响

    CXCL12(0、50、100ng/ml)与人胃癌AGS细胞共同培养48h，收集培养上清液检测金属基质蛋白酶MMP?9的活性。结果显示CXCL12可以增强人胃癌AGS细胞MMP?9的活性（图2）。空白对照组中，MMP?9相对表达强度为（28.4±3.0）%，50、100ng/ml CXCL12处理后，MMP?9相对表达强度分别为（54.7±5.6）%、（74.4±6.3）%，与空白组比较差异有显著性意义（P均＜0.05）。

    图2  CXCL12对AGS细胞MMP?9活性的影响

    2．4  CXCL12对AGS细胞分泌VEGF的影响

    培养的人胃癌AGS细胞未受到CXCL12刺激时，其细胞培养上清液中VEGF的浓度为(38.31±6.26)pg/ml；随着CXCL12刺激浓度的增加，人胃癌AGS细胞分泌VEGF浓度也逐渐增高。当以50ng/ml和100ng/ml的CXCL12刺激时，VEGF浓度分别为(152.45±12.72)pg/ml和(223.63±15.20)pg/ml，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

    图3  不同浓度CXCL12对人胃癌AGS细胞分泌

    VEGF(pg/ml)的影响

    3  讨  论

    趋化因子CXCL12也称为基质细胞衍生因子?1(stromal cell?derived factor?1,SDF?1)，属于β类趋化因子亚家族成员。CXCL12与受体CXCR4结合后，介导淋巴细胞的定向迁徙，在机体免疫和炎症反应过程中发挥重要作用[2]。最近研究发现CXCL12/CXCR4在肿瘤的侵袭、转移中发挥重要作用[3]。温国明等对趋化因子受体CXCR4表达与胃癌预后之间的关系进行了研究，结果发现：CXCR4在胃癌标本中阳性表达率为41.3%(76/184例)，说明CXCR4的表达与胃癌的分化程度、胃癌淋巴结转移相关[4]。

    本实验中，我们选择表达CXCR4的人胃癌AGS细胞作为研究对象，观察CXCL12对AGS细胞体外侵袭力的影响，结果发现，CXCL12可明显增强AGS细胞的体外侵袭能力。

    侵袭性与转移性是恶性肿瘤最重要的生物学行为，也是肿瘤病人致死的主要原因[3]。肿瘤的侵袭和转移包括细胞粘附、蛋白酶水解组织基质以及细胞迁移等进程。金属蛋白酶(MMPs)等多种蛋白水解酶介导的细胞外基质及基底膜的降解，是肿瘤侵袭转移的一个关键步骤。研究表明[5～7]，明胶酶在多种恶性肿瘤组织、培养的肿瘤细胞及癌基因转化细胞中活性增强，体外侵袭实验均证实肿瘤细胞的高侵袭能力与明胶酶的活性增强有关，因而被认为可能是肿瘤侵袭、转移过程中的主要蛋白水解酶。本研究中对AGS细胞上清液进行明胶酶谱分析，对照组AGS细胞培养上清仅见微弱负染条带，说明AGS细胞自分泌少量MMP?9，活性较弱，当给予CXCL12刺激时，基质金属蛋白酶MMP?9的活性逐渐增强。表明CXCL12可增加基质金属蛋白酶的表达与分泌，从而促进胃癌肿瘤的侵袭和转移。

    肿瘤组织的生长及侵袭转移需要新生血管的生成以保证足够的氧供和营养物质供应，而血管生成是一个严格控制的生物学过程，它同肿瘤的生长和转移密切相关。血管内皮细胞生长(VEGF)在血管形成中发挥重要的作用[8]。我们采用ELISA法检测AGS细胞培养上清中VEGF含量，发现CXCL12刺激AGS细胞后，可增加VEGF的分泌。表明CXCL12可使肿瘤内VEGF的生成和分泌增加，促进肿瘤的生长和侵袭。

    以上的结果说明，CXCL12可以通过诱导胃癌细胞生成和分泌基质金属蛋白酶MMP?9和VEGF，导致肿瘤细胞侵袭能力的增加，进而导致了胃癌高度侵袭性的生物学行为。

【】
  [1]Charoenrat PO, Rhys?Evans PH, Eccles SA. Expression of matrix metalloproteinase and their inhibitors correlates with invasion and metasis in squamous cell carcinoma of the head and neck[J]. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 2001, 127 (7): 813

[2]Cascieri MA, Springer MS. The chemokine chemokine?receptor family: potential and progress for therapeutic intervention[J]. Curr Opin Chem Bio, 2000, 4(4): 420

[3]Muller A，Homey B，Soto H, et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J]. Nature,2001,410 :50

[4]温国明，郭悦青.趋化因子受体CCR7和CXCR4在胃癌中的表达[J].广东医学，2006，27(7):968

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[6]Strup?Perrot C, Vozenin?Brotons MC, Vandamme M, et al. Expression and activation of MMP ?2, ?3, ?9, ?14 are induced in rat colon after abdominal X?irradiation[J]. Scand J Gastroenterol, 2006, 41 (1): 60

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[8]Stephan Branda, Julia Dambachera, Florian Beigel,et al. CXCR4 and CXCL12 are inversely expressed in colorectal cancer cells and modulate cancer cell migration, invasion and MMP?9 activation[J]. Exper Cell Res，2005，310:117（收稿日期：2008?06?13）