黄芪对哮喘大鼠肺组织p38蛋白激酶表达的影响
【摘要】 目的 探讨支气管哮喘大鼠肺组织p38蛋白激酶（p38 MAPK）表达的变化以及黄芪注射液对其影响。 方法 应用鸡卵清蛋白（OVA）腹腔注射致敏和反复超声雾化吸入刺激复制大鼠哮喘模型。随机分成3组：正常对照组、哮喘模型组和黄芪干预组。分别采用酶联免疫吸附法（ELISA）和蛋白质印迹检测支气管肺泡灌洗液（BALF）IL?5含量和肺组织磷酸化p38 MAPK表达的变化，并观察BALF中EOS计数以及肺组织病变化。 结果 哮喘模型组大鼠肺组织磷酸化p38 MAPK表达水平及BALF中IL?5含量和EOS计数均较正常对照组显著增加（P<0.01）；黄芪干预组的上述改变较哮喘模型组显著降低（P<0.01），肺组织病理学损伤程度明显减轻。肺组织磷酸化p38 MAPK表达水平与BALF中IL?5含量和EOS计数之间分别呈显著正相关（r=0.73，0.65，P<0.01）。 结论 p38 MAPK可能参与了支气管哮喘的发病过程，黄芪对哮喘的作用可能部分与抑制磷酸化p38 MAPK的表达有关。
【关键词】 支气管哮喘；丝裂原活化蛋白激酶；黄芪
ABSTRACT Objective To explore the effect of astragalus injection on the expression of p38 mitogen?activated protein kinase (p38 MAPK) in asthmatic rats. Methods Ovalbumin (OVA) was injected intraperitoneally and inhaled to produce the asthmatic model. Twenty?four rats were randomly divided into three groups: control group, asthma group and astragalus group. The concentration of IL?5 in BALF and the expression of phospho?p38 MAPK in lung tissue were measured by ELISA and Western blot, respectively. Results The expression of phospho?p38 MAPK was up?regulated in the lung tissue of asthmatic rats. Compared with asthma group, astragalus injection significantly decreased the expression of phospho?p38 MAPK , the concentration of IL?5 and the number of eosinophil in BALF (P<0.01), and alleviated the histopathological damage of lung tissue. There were positive correlations between the expression of phospho?p38 MAPK and the concentration of IL?5 and the number of eosinophil in BALF. Conclusion p38 MAPK may play a role in pathological process of asthma. Astragalus could effectively treat asthma by inhibiting the expression of p38 MAPK.
KEY WORDS： Asthma；p38 mitogen?activated protein kinase; Astragalus
新近研究表明，p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen?activated protein kinase，p38 MAPK）是细胞内重要的信号传递者，参与了对多种炎症细胞因子和多种类型的细胞应激信号的传导，在哮喘的发生和过程中有着重要作用[1，2]。黄芪作为传统中药，可通过降低患者气道高反应性[3]，调节患者免疫功能[4],从而对支气管哮喘有一定的治疗作用。本研究通过观察黄芪对哮喘大鼠肺组织p38蛋白激酶表达的影响，为阐明黄芪治疗哮喘的作用机制提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 大鼠哮喘模型的建立和分组
雄性SD大鼠24只，体质量220±40g，2～3月龄，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。随机分成3组：A组为正常对照组，以生理盐水代替抗原进行注射和雾化吸入；B组为阳性对照组，给予鸡卵清蛋白（OVA，美国Sigma公司）致敏和刺激复制哮喘模型；C组为黄芪干预组，每天予以OVA雾化吸入前分别给予黄芪注射液（每毫升含黄芪2g，成都地奥制药公司）2.5ml/kg腹腔注射。大鼠致敏及刺激方法参照[5]进行。腹腔注射抗原液1ml含OVA 100 mg，灭活的百日咳杆菌疫苗5×109个和AL（OH）3干粉100mg致敏，2周后采用402型超声雾化器（上海四菱医疗器械厂）喷雾1% OVA 20min激发，1次/d，共2周。
1.2 支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞因子IL?5含量的检测
腹主动脉放血处死动物，分离气管，结扎右侧主支气管。以4ml磷酸盐缓冲液（PBS）进行左肺灌洗，保留30s，回收灌洗液，200×g离心10min，取上清?20℃保存。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定IL?5含量（晶美公司试剂盒）。取右肺下叶，放入液氮中速冻，?80℃保存，以提取组织总蛋白。
1.3 BALF细胞涂片、细胞计数和分类
用1ml生理盐水悬浮BALF中的细胞沉淀，取一滴悬液在细胞计数板上进行细胞计数，取剩余部分悬液进行细胞涂片，固定，HE染色，光学显微镜下进行细胞分类，嗜酸性粒细胞（EOS）的百分比和绝对值。
1.4 肺组织磷酸化p38 MAPK表达的检测
速取冻存的肺组织约100mg，放入匀浆器中，加入5倍体积的BufferⅠ（0.1M NaCl，0.01M Tris.Cl，pH7.6，0.001M EDTA，pH8.0，1μg/ml抑肽酶，100μg/ml PMSF），冰上匀浆10min。加入等体积的Buffer Ⅱ（0.1M Tris.Cl，pH 6.8，0.2M DTT，4% SDS，20% 甘油），沸水浴中加热10min。4℃，10000×g离心10min，取上清?70℃保存备用。Bradford法测其蛋白浓度。各组取总蛋白50μg加上样缓冲液（50mM Tris.Cl,pH6.8, 2% w/v SDS, 10% v/v glycerol, 1%β?巯基乙醇，0.01%溴芬蓝）进行十二烷基磺酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS?PAGE）分离蛋白质，经电转印将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上（NC膜，Amersham公司）。NC膜经漂洗、封闭后加入稀释度为1∶400的兔抗磷酸化p38多克隆抗体（美国 Santa Cruz公司），4℃，孵育20h。然后加入辣根过氧化物酶标记的、稀释度为1∶200的羊抗兔IgG，室温孵育1h。经TBS洗涤，DAB显色。用图象分析仪测定各条带的光密度值（OD）作定量分析。
1.5 肺组织病理学观察
取右肺部分组织，中性福尔马林溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，HE染色，观察气道、肺组织病理学改变。
1.6 统计学处理
全部数据均以±s表示，各组间差异的显著性采用方差分析的q检验，两变量的相关程度用直线相关分析法分析。
2 结 果
2.1 各组大鼠BALF中EOS计数和IL?5含量的变化
哮喘对照组大鼠BALF中EOS计数和IL?5含量均较正常对照组显著升高（P<0.01）。黄芪干预后三者虽较正常对照组高，但均显著低于哮喘对照组（P<0.01），见表1。表1 各组大鼠BALF中EOS计数（×104cell/ml）
2.2 肺组织磷酸化p38 MAPK表达的变化
蛋白质印迹结果显示大约在38KD的分子量位置上出现阳性条带。经图像分析发现，哮喘对照组大鼠肺组织磷酸化p38 MAPK的表达较正常对照组显著增加，其光密度值为正常对照组的3.02倍（P<0.01）。应用黄芪干预后，肺组织磷酸化p38 MAPK的表达较哮喘对照组明显下降（P<0.01）, 见表1。
2.3 肺组织磷酸化p38 MAPK的表达水平与BALF中EOS计数和IL?5含量之间的相关分析
肺组织磷酸化p38 MAPK表达的平均光密度值与BALF中EOS计数和IL?5含量之间分别呈显著正相关（r=0.73，0.65，P<0.01）。
2.4 肺组织病改变
哮喘对照组大鼠的肺组织HE染色可见支气管上皮细胞肿胀、脱落，支气管平滑肌收缩，管腔狭窄，支气管壁及管腔内有大量EOS和淋巴细胞浸润，黏膜及黏膜下层水肿明显。黄芪干预组大鼠的肺组织病理学改变较哮喘对照组显著减轻。正常对照组大鼠的肺组织无明显变化。
3 讨 论
目前认为哮喘的本质是一种慢性气道炎症，但其发病的分子机制尚不清楚。p38 MAPK是1993年由 Brester等人[6]在研究高渗环境对真菌的影响时发现的，由360个氨基酸组成的38kD蛋白，属应激激活的蛋白激酶，与炎症、应激反应的调控密切相关。近年来，越来越多的研究资料表明p38 MAPK可能在支气管哮喘发病机制的多个环节发挥重要作用。如Mulroy等[7]认为胸腺微环境信号刺激能诱导胸腺细胞p38 MAPK活化，破坏胸腺结构能下调p38 MAPK的活性。应用特异性抗体和流式细胞仪技术证实p38 MAPK的活性在前TCR介导的胸腺细胞由CD4-CD8-向CD4+CD8+转变的过程中发挥重要作用，抑制p38 MAPK活性能阻断ɑβT淋巴细胞的正常发育和成熟。而且，多种研究结果表明p38 MAPK可通过作用于转录因子c?Maf、NF?AT及GATA?3等参与了对Th2类细胞因子（如IL?4，IL?5）基因表达的调控[8，9]。本实验结果表明OVA诱导支气管哮喘大鼠肺组织磷酸化p38 MAPK的表达显著增加，提示p38 MAPK活化增强；而且磷酸化p38 MAPK的表达水平与BALF中EOS计数和IL?5含量之间分别呈显著正相关，进一步证实p38 MAPK可能参与了哮喘发病机制的调控。
黄芪作为益气养血的扶正药物，具有补气固表、利尿托毒、敛疮生肌的功能。黄芪注射液含有活性较强的三萜皂甙、黄酮类、多糖类、氨基酸和微量元素，能抗菌、抗病毒、提高机体免疫功能[10]。本实验研究发现应用黄芪干预后，肺组织病理学改变较哮喘模型组显著减轻，大鼠BALF中EOS计数和IL?5含量、肺组织磷酸化p38 MAPK的表达较哮喘模型组明显下降，提示黄芪注射液对哮喘大鼠具有保护作用，其机制可能与抑制p38 MAPK的磷酸化活化有关。我们还发现应用黄芪干预后，大鼠BALF中EOS计数和IL?5含量、肺组织磷酸化p38 MAPK的表达虽较哮喘模型组明显下降，但仍高于正常对照组，提示存在未被黄芪作用的其他机制共同参与了哮喘病理生理过程。
【】
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