非小细胞肺癌组织中p53和雌激素受体的表达及其临床意义与相关性
【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中p53蛋白和雌激素受体(ER)表达与临床病理的相关性。 方法 应用免疫组织化学S?P法检测63例 NSCLC癌组织标本及20例良性病变中p53、ER的表达。 结果 p53总阳性率为52.3%(33/63)，其中鳞癌阳性率为55.2%(21/38)，腺癌阳性率48.0%(12/25)，而20例良性病变中均未检测到p53阳性表达。ER总阳性率为74.6%(47/63)，其中鳞癌阳性率65.8%(25/38)，腺癌阳性率88.0%(22/25)，在20例良性病变中均无ER表达。p53、ER的阳性表达与性别、年龄、组织学类型及病理分级无明显相关。 结论 p53和ER在NSCLC中的表达可视为两个独立的因素并以各自独立的方式参与肺癌的发生。在ER表达阳性的病例中，临床上辅以内分泌可奏效。
【关键词】 非小细胞肺癌；p53蛋白；雌激素受体；表达
ABSTRACT：Objective To investigate the relationships between expression of tumor suppressor gene P53,estrogen receptor (ER) and clinic pathology in human non small lung cancer (NSCLC).Methods The expression of P53 protein and ER in 63 NSCLC specimen and 20 specimen from patients with benign lung disease were detected by SP immunonhistochemistry method.Results 52.3% tumor tissues had positive P53 staining, and the positive rate in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma was 55.2% and 48.0%,respectively;74.6% tumor tissues had positive expression of ER,and the positive rate in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma was 65.8% and 88.0%,respectively.There was no expression of p53 and ER in benign pulmonary lesion tissues.The positive rates of p53 and ER expression were not associated with gender,age,histology type and pathological steps.conclusion The expressions of P53 and ER in NSCLC can be considered to be two independent factors involved in the occurrence and development of lung cancer.
KEY WORDS：Lung cancer;p53 protein;Estrogen receptor；Expression
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。肺组织细胞癌变和恶性肿瘤的形成是多因素、多阶段和多步骤的结果[1～4]，其中p53基因突变或失活后失去对细胞周期负调控作用，可导致恶性肿瘤发生，并且突变的p53蛋白失去抑癌功能外，还有促进正常细胞恶性转化的活性[5]。此外，有研究表明[6]，性激素可能与肺癌的发生发展密切相关，尽管通常认为肺不是性激素的靶器官，但不少学者的实验证实了人胚胎与兔肺组织内存在雌激素受体(ER)，从幼年到成年对机体有一定作用。人们对ER在肺癌中的表达及其临床价值有不同见解。我们用免疫组织化学法检测了63例非小细胞肺癌(NSCLC)石蜡包埋组织，并结合临床病理资料，进一步探讨p53蛋白阳性表达与NSCLC临床病理的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
选择经手术切除和病理证实的NSCLC患者63例，患者年龄28～73岁，平均56岁。其中男51例，女12例。鳞癌38例，其中高分化鳞癌11例，中分化鳞癌15例，低分化鳞癌12例;腺癌25例，其中高分化腺癌9例，中分化腺癌6例，低分化腺癌10例。有淋巴结转移48例。另选肺良性病变患者20例作为对照，平均年龄45岁，其中肺结核9例，支气管扩张6例，肺炎性假瘤3例，癌旁组织2例。
1.2 试剂
鼠抗人p53蛋白抗体(购自武汉博士德生物试剂公司)， ER单克隆抗体（购自北京博奥森生物试剂公司）， SP免疫组化试剂盒及 DAB显色试剂盒(购自武汉博士德生物试剂公司)。
1.3 免疫组织化学染色
取肿瘤组织标本蜡块，制成4μm厚切片，采用免疫组化链霉素生物素蛋白?过氧化酶(S?P)法，免疫组化染色按SP 试剂盒操作说明进行。根据说明书对部分抗原(p53、ER）进行微波抗原修复。用Tris缓冲液代替一抗作阴性对照，用已知乳腺阳性切片作阳性对照。
1.4 结果判定
p53单克隆抗体以肿瘤细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞， ER以肿瘤细胞核或胞浆出现典型棕黄色颗粒为阳性。阳性细胞数目在10%～25%为(+)，25%～50%为(++)，超过50%为(+++)。每次实验均设阳性和阴性对照。p53蛋白用已知肺癌阳性切片作对照，用正常肺组织做阴性对照；ER用已知乳腺癌阳性切片作阳性对照，阴性对照用PBS代替一抗。
1.5 统计学处理
所有数据均以统计学软件SPSS 11.5进行分析处理，采用卡方检验及Fisher’s精确概率法，P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 p53、ER在肺癌组织和肺良性病变组织中的表达
63例肺癌组织中， p53阳性表达33例(52.3%)，ER阳性表达47例(74.6%)；而20例良性病变中均无p53及ER阳性表达。提示P53、ER的表达与肺癌发生发展有显著相关性(P<0.05)。(图1～4)
2.2 p53表达免疫组化结果与临床病理的关系
p53蛋白定位于肿瘤细胞核内，肺组织和非肿瘤组织均为阴性。本组p53总阳性率为52.3%(33/63),其中鳞癌阳性率为55.2%(21/38),腺癌阳性率为48.0%(12/25)。由表1所示, p53蛋白的阳性表达与患者性别、年龄、组织学类型、病理分级及有无淋巴结转移均无显著相关性(P均>0.05)。
2.3 ER表达免疫组化结果与临床病理的关系
ER阳性表达定位于肿瘤细胞胞核和胞浆,总阳性率74.6%(47/63),其中鳞癌阳性率为65.8%(25/38),腺癌阳性率为88.0%(22/25)。如表1所示,ER阳性表达与患者年龄、性别、病理分级及有无淋巴结转移无显著相关性(P均>0.05)。表1 P53、ER在非小细胞癌中的表达与临床病理关系
2.4 p53、ER在NSCLC中表达的相关性
p53和ER均为阳性有26例，均为阴性有9例，即仅有55.6%（35/63）表达一致，经统计学分析可见p53和ER的表达在NSCLC中无显著相关性（P>0.05)。
3 讨 论
正常的p53基因(野生型）编码?53KD核结合蛋白，能监控细胞基因组的完整性[7]。当出现DNA损伤或异常时，启动程序性死亡机制，清除这种异常细胞，该基因发生突变后，将丧失这种监控功能，使突变细胞逃逸凋亡，导致恶性肿瘤发生[8]。突变型p53对细胞的生长起负性调控作用，用免疫组化方法检测到阳性标记的p53均为突变型p53蛋白，具有致癌效应。本实验中52.3%肺癌标本中p53蛋白阳性表达，也表明p53基因突变在肺癌的发生中起重要作用。虽然以往有人认为p53的表达与病理分级以及有无淋巴结转移有关联，在分化好、无转移的病例中p53的表达要低于分化差、有转移的病例，但本实验却表明p53在NSCLC中的异常表达与性别、年龄、组织学类型、病理分级及有无淋巴结转移并无显著相关性（P均>0.05)，所以p53的表达只能指导，而不能在临床上作为判定患者预后好坏的指标。
除了雌激素作用的经典靶器官乳腺和子宫发生的恶性肿瘤外，有不少研究表明[9]，雌激素与肺癌的发生发展密切相关。尽管通常认为肺不是雌激素的靶器官，但不少学者的实验证实了在食管癌[10]、胃癌、肝癌和肺癌等这些激素作用的非经典靶器官中均检测到雌激素。人们对ER在肺癌中的表达及其临床价值有不同见解。国内张容轩[11，12]等用免疫组化法对146例各种类型的原发性支气管肺癌进行ER检测，ER阳性率58.9%，结果还显示ER阳性率与肿瘤分化程度呈正相关，与肿瘤组织的分期呈负相关，与组织学类型无关。本实验显示：ER在肺癌中的阳性表达率为74.6%，在肺癌中的表达显著高于良性对照组0.0%（0/20）（P＜0.05)，这与张容轩报道相符，提示雌激素很可能参与肺癌的发生发展。有研究表明[9]，雌激素对肺肿瘤的作用可能是以受体为中介的：雌激素进入靶组织，在胞浆里与水溶性受体蛋白ER结合成激素?受体复合物，经过转化和移位进入细胞核成为核受体，核受体对DNA有高度亲和作用，经转录、翻译作用可产生具有生物调节活性的蛋白质，从而影响细胞的代谢、生长、分裂等。而且，雌激素与肺癌的关系有着复杂的两重性[13]，一方面有致癌性，另一方面又有抑癌作用。机体内激素环境的失衡、性激素缺乏和过多可能是导致肿瘤的诱因。性激素本身不是致癌物质，但是它能促进靶细胞的增殖，另外[14～16]，性激素还可以促进增殖迅速的细胞向恶性细胞转化的生物学行为。因此，由于ER与NSCLC的发生发展显著相关（P＜0.05),可提示临床上辅以内分泌治疗肺癌可有一定疗效。本实验还显示ER阳性表达率与组织学分型、细胞分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移无显著相关（P均＞0.05)，与张容轩报道不太一致。因此，雌激素在肺癌发生发展中的作用有待进一步研究。
已有研究表明[17～18]，在乳腺，即雌激素作用的经典靶器官发生的恶性肿瘤中，p53有较高的阳性反应率，与肿瘤大小、病理类型、组织分化及有无淋巴结转移无关，但与ER有关。这些研究均发现p53突变和ER两参数间有密切关系。现在公认ER阴性患者生存期短，是乳腺癌患者预后不良的指标，说明p53基因突变丧失了对细胞恶性表型的抑制，乳腺癌细胞更具有不良的生物学恶性行为。在乳腺癌中p53基因表达与ER状态呈负相关。
也有研究表明[19]，关于食管这种雌激素作用的非经典靶器官发生的恶性肿瘤中，p53蛋白表达与ER蛋白阳性也密切相关。人正常食管组织不表达ER蛋白，当发生癌变后，人食管组织具有表达ER蛋白的能力，这可能是p53基因突变后，产生了许多没有活性的p53蛋白，改变了p53基因对许多基因的调控，也影响了对ER基因的调节，从而使ER得到表达。即p53蛋白表达与ER蛋白阳性呈正相关。
那么在肺部肿瘤中，p53基因表达与ER蛋白阳性表达有无相关性呢。本实验表明，两者并无显著相关性（P＞0.05)。p53基因是人类肿瘤最常发生改变的基因，p53基因主要是点突变[20]，其中以G→T颠换最多，另有少量插入或缺失突变。p53基因的突变和缺失是肿瘤发生的早期分子事件，突变型p53基因丧失对细胞周期G1?S节点的调节作用，细胞进入S期之后，加速了DNA的复制和异常的核分裂，在形态表现为明显的异型性。p53基因及其产物可能通过参与细胞周期的负调节而调控细胞的增生和分化。野生型p53基因可以在细胞分化过程中DNA发生损伤时，高水平表达其蛋白，通过启动修复系统，并给予足够时间进行DNA修复，阻止具有癌变倾向的细胞产生；而突变型p53基因则刺激细胞分裂。p53基因的点突变或缺失不仅引起其本身抑癌活性的丧失，而且还促进细胞的恶性转化和癌细胞生长，这时的p53基因已经由抑癌基因转变为癌基因，导致NSCLC的发生发展。而在NSCLC中，ER依赖性肿瘤的增殖可通过以下机制[21，22]：①调节细胞分裂有关的早期基因，如c?myc、c?jun和c?fos的表达促进DNA合成和细胞分裂。②刺激生长因子如EGF、IGF?Ⅱ、TGFα的表达而促进细胞增殖。③调节与细胞周期有关的调节蛋白，如cyclin?B2的表达而影响细胞增殖。因此，本实验初步表明在NSCLC中，p53和ER可视为两个独立的因素并以各自独立的方式参与肺癌的发生发展，其在NSCLC中的生物学行为有待进一步研究证实。
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