每周重复照射建立大鼠放射性肺损伤模型的评价

              作者：张海，王炳胜，刘秀芳，李凤玉，雒书鹏，李宏伟，石军

【摘要】  目的 评价每周小剂量重复照射大鼠放射性肺损伤模型的可行性、性及实用性。方法 36只Wistar种雌性大鼠，按5：1比例随机分为照射组（A组）30只、对照组（B组）6只。6?MV直线加速器对A组大鼠右肺进行分次照射(5Gy/次，1次/周，累积剂量最高为30 Gy)，于照射后第4、6、8、12、26周处死， 每时相点处死6只，B组于第4周末处死。观察动物活体外观、肺的大体标本、行HE染色观察大鼠肺组织学变化、ELISA法检测血清和SP法检测肺组织中的TGF?β1蛋白表达。结果 A组受照肺组织表现出放射性肺炎及肺纤维化，大鼠血清和肺组织TGF?β1表达第4周表达升高，到第12周达到高峰，26周下降。结论 每周小剂量重复照射所制作的大鼠放射性肺损伤模型稳定可靠，动物死亡率低，符合临床放疗实际。

【关键词】  放射性肺损伤；大鼠；模型

　　Abstract： Objective     To evaluate the feasibility, rationality and practicability about the model of radiation?induced lung injury of rat caused by weekly repeated low dose radiation. Methods     At a ratio of five to one,36 Wistar rats were randomly divided into irradiation group(A group,n=30) and control group(B group,n=6). A group was irradiated fractionally by 6?kv linear acceleratorat at right hemithorax(5Gy every time, once a week, highest accumulated dose 30Gy), six of which were killed on 4rd、6 th、8 th、12 th and 26th week after radiation. And B group were killed on 4rd week after radiation.Then we observed the living appearance of rats, general sample of radiated lung,histological change of lungs stained with HE,the expression of TGF?β1 of blood serum by ELISA and lung by SP.Results     Display of radiating pneumonia and lung fibrosis are observed in radiated lung histology of the A group rats.TGF?β1 level in serum and lung of the A group rats showed an increase from 4th week after the first  radiation, reaching the highest level at 12th week,and descending at 26th week. Conclusion     The model of radiation?induced lung injury of rat caused by weekly repeated low dose radiation is stable and reliable,has lower death rate, conform with the practise of clinical radiation therapy.

　　Key  words： radiation?induced lung injury;rat;model

　　放射性肺损伤是胸部肿瘤放疗最常见的并发症。轻者症状轻微，可自行消退。一旦发生放射性肺炎及晚期肺纤维化，在影响疗效的同时，还严重影响患者的呼吸功能及生活质量，甚至引起呼吸衰竭，危及生命。如何模拟临床放疗实际制作放射性肺损伤动物模型，对防治放射性肺损伤的研究显得非常重要。本实验模拟临床放射的过程，对大鼠进行每周末小剂量重复照射建立放射性肺损伤模型，通过多种方法评价该模型的可行性、科学性、实用性。

　　1     材料与方法

　　1.1     材料

　　1.1.1     动物来源     健康成年清洁级雌性Wistar大鼠36只，体重180～200 g，由医学科学院医学实验动物中心提供，供试前在清洁动物房常规饲养3 d，观察无异常者入组实验。

　　1.1.2     抗体及检测试剂     TGF?β1血清检测试剂盒（R&D公司，美国）。兔抗TGF?β1多克隆抗体试剂盒，由武汉博士德生物工程有限公司生产。

　　1.2     方法

　　1.2.1     分组     按5：1比例，随机抽签分为两组：照射组（A组）30只和正常对照组6只（B组）。

　　1.2.2     照射方法     A组大鼠均采用6MV?X直线加速器照射右肺，照射前使用戊巴比妥钠0.04 g/kg 腹腔麻醉，俯卧于平台，模拟机下定位，铅块遮挡左肺及纵隔，照射野3 cm×3 cm，总量30 Gy，5 Gy/次，每周1次，照射后等待大鼠苏醒，B组大鼠只麻醉不进行照射。

　　1.2.3     取材     A组大鼠分别于照射后4、6、8、12、26周末，每次随机抽取6只，戊巴比妥钠0.04 g/kg 腹腔麻醉后，称重并记录，而后立即处死，迅速切开胸腔。B组6只大鼠于第4周末处死做对照。用5 ml 注射器从大鼠右心房抽取血液5 ml 缓慢注入离心管，在室温静置30 min，在3 000 r/min 的条件下离心，收集上清液置入冻存管中，在-80 ℃ 条件下冻存。取右肺置于10%甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋。

　　1.3     观察指标       （1）动物活体外观：体重、精神状态、进食、排便、毛发脱落。（2）肺系数：天平称肺重，计算肺系数。肺系数=肺重（mg）/体重（g）。（3）大体标本观察：肺组织表面、颜色、质地、弹性、有无肿胀、有无充血、出血。（4）肺组织形态学变化：石蜡块4 μm 厚连续切片，HE染色观察肺组织并计算平均肺泡间隔宽度，每张切片在400倍显微镜下取5个视野，用病理图象分析仪分别测量肺泡壁宽度和肺泡腔宽度，求平均值，计算平均肺泡间隔宽度。平均肺泡间隔宽度=平均肺泡壁宽度/平均肺泡腔宽度。（5）血清TGF?β1检测：用ELISA方法，按TGF?β1检测试剂盒说明书进行，每组设6个平行孔，同时作对照孔。（6）肺组织TGF?β1的表达：石蜡块4 μm 厚连续切片，采用SP法，按照TGF?β1试剂盒操作程序进行免疫组化染色。光镜下观察胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性。在200倍显微镜下取5个视野，用病理图象分析仪对免疫组化染色的积分光密度（integrated optical density，IOD）进行定量分析，计算免疫组织化学染色阳性细胞反应物质的平均IOD值，其值代表切片中相应抗原性的相对强度。

　　1.4     统计学方法     实验数据以 x±s表示。应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。P<0.05表示有统计学意义。

　　2     结果

　　2.1     动物活体外观     观察期间，各组动物均无死亡，B组体重增加，体格健壮，食欲好，毛发有光泽。A组大鼠自实验第3周开始出现精神萎靡，反应迟钝，饮食、排便、活动均减少，自第12周精神逐渐好转，活动逐渐增多。皮毛自放疗后第2周光泽晦暗，开始脱落，第6周末部分大鼠照射野可见大片毛发脱落。但皮肤未发生湿疹、红斑、糜烂和溃疡。

　　2.2     大体标本观察     B组肺叶外观无异常，表面光滑、饱满，质软，弹性好，呈粉红色。A组照射4周后累积剂量20 Gy 时出现肺叶肿胀，少量新鲜出血点，质软，弹性较好；照射6周后（累积剂量30 Gy）、8周后（照射结束2周）肺叶颜色变深、体积增大、表面光滑、呈点状和斑片状出血灶明显增多，切面有大量泡沫样液体渗出，但照射6周后较重；照射12周后（照射结束6周）肺叶肿胀已经消失，表面有微小凹陷，可见明显散在瘀斑；照射26周后肺叶体积缩小，呈灰黄色或灰白色，表面凹凸不平，质硬，弹性差。照射6周后（累积剂量30Gy），照射组肺系数明显高于对照组（P<0.05），详见表1。

　　表1      两组大鼠肺系数比较（略）

　　与对照组比较，①P＜0.05

　　2.3     肺组织形态学变化
      
　　B组肺组织学结构正常。A组照射4周后（累积剂量20 Gy）、6周后（累积剂量30 Gy）、8周后（照射结束2周）受照肺组织病变以渗出为主，肺间质及肺毛细血管充血，间质水肿致肺泡壁轻度增厚，部分肺泡间含水肿液，上述征象照射6周后最明显；照射12周后肺泡充血水肿，肺泡上皮增生，肺泡腔缩小，肺泡间隔增宽，肺泡壁细胞增多，主要为成纤维细胞、巨噬细胞、淋巴细胞；照射26周后，肺泡间隔重度增宽，肺泡腔明显变小甚至消失，可见成纤维细胞和泡沫细胞，纤维组织增生，胶原化明显，部分可见灶性钙化（HE染色见封4图1）。照射组平均肺泡间隔宽度明显大于对照组（P<0.05），详见表2。

　　表2     两组大鼠平均肺泡间隔宽度比较（略）

　　与对照组比较 ①P＜0.05；②P＜0.01    

　　2.4     肺组织TGF?β1蛋白表达     镜下可见肺组织中TGF?β1 阳性表达主要在肺泡上皮细胞、巨噬细胞、支气管黏膜上皮细胞、间质细胞等的胞浆中，颜色越深表达越强，多数细胞核呈蓝色，部分细胞核呈棕黄色。空白对照组肺组织TGF?β1蛋白呈弱表达。A组大鼠TGF?β1蛋白表达强度较B组强，随时间延长表达逐渐增强，于12周达高峰，于26周表达呈减弱的趋势。各组各时相点表达见封4图2。

　　2.5     大鼠血清和肺组织TGF?β1蛋白定量分析     大鼠血清和肺组织TGF?β1表达第4周表达升高，到第12周表达到高峰，26周下降，详见表3。

　　表3     大鼠不同时相TGF?β1的表达（略）

　　与对照组比较，①P＜0.05

　　3     讨论
         
　　放射性肺损伤的动物实验大多是采用单次大剂量照射，若干天后再进行有关研究。此种造模方式，动物致死率高，可靠性差，不符合放疗患者长时间、反复接受照射的临床实际。本研究成功地采用每周末小剂量重复照射制作大鼠放射性肺损伤模型，更符合临床实际。

　　3.1     该模型可行性评价     很多研究者动物造模[1～2]采用小鼠，然而小鼠肺体积小，单肺放射野难于控制，全肺照射因小鼠不能耐受而使死亡率增高，影响实验结果的准确性。在放射性肺损伤的影像学动物模型选择方面，有的学者采用更接近于人肺体积大小的实验动物如猪、狗等作为模型是理想的选择[3～4]，然而实验操作难度很大，实验费用昂贵，长时间的动物饲养包括观察随访都比较困难。研究表明大鼠的肺体积是小鼠的10倍[5]。因此，本实验采用Wistar大鼠小剂量重复照射方法制作放射性肺损伤动物模型有以下特点：(1)在观察期间，受照大鼠曾一度出现精神萎靡，反应迟钝，饮食、排便、活动均减少，但照射12周后逐渐好转；(2)照射野皮毛发生脱落，甚至照射6周后部分大鼠照射野可见大片毛发脱落，但皮肤未发生湿疹、红斑、糜烂和溃疡；(3)实验动物没有一只死亡；(4)便于右肺单野的设计，铅挡保护左肺；(5)降低研究成本。可见每周小剂量重复照射方法制作大鼠放射性肺损伤动物模型是可行的。

　　3.2     该模型性评价     国外学者[6]通过动物实验的病理改变提出放射性肺损伤分为3 期：间质肺水肿期、肺泡炎期和间质纤维化期。国内白蕴红等[7]分之为4 期，即早期以渗出为主(0.5～1个月)；中期以肉芽形成为主(2～3个月)；后期以纤维化为主(3～6个月)；晚期以胶原化为主(6个月以后)。本实验观察周期为26周，照射4周后、6周后、8周后受照肺组织病变以渗出为主，肺间质及肺毛细血管充血，间质水肿致肺泡壁轻度增厚，部分肺泡间含水肿液；照射12周后受照肺组织病变以渗出和增殖为主，肺泡充血水肿，肺泡上皮增生，肺泡腔缩小，肺泡间隔增宽，肺泡壁细胞增多，主要为成纤维细胞、巨噬细胞、淋巴细胞；照射26周后，肺泡间隔重度增宽，肺泡腔明显变小甚至消失，可见成纤维细胞和泡沫细胞，纤维组织增生，胶原化明显，部分可见灶性钙化。这些均与单次大剂量照射造模相同，符合放射性肺损伤的发病[6～7]。
      
　　多数学者认为TGF?β1是介导放射性肺损伤的最重要的细胞因子，能作用于多个环节，不仅趋化多种细胞参与炎症反应，促进成纤维细胞的增殖分化，而且刺激各种细胞外基质成分的合成和沉积，抑制蛋白水解酶的产生，使细胞外基质沉积进一步增加。本实验显示，受照大鼠第4周末，血清和受照肺组织TGF?β1表达升高，到第12周表达到高峰，26周略有下降，这种表达规律与报道[8]相一致，不同品系动物在接受照射后，TGF?β1始终都在表达，有时还出现表达高峰。因此，本实验显示：每周小剂量重复照射方法制作大鼠放射性肺损伤模型是科学的、合理的。

　　3.3     该模型实用性评价     目前有放疗设备的单位，普通放疗、适形放疗、调强放疗均以每周5 d，星期天休息。本实验每周末小剂量重复照射，不仅符合临床长时间、反复照射的模式，而且不影响临床工作，不增加设备的日负荷，减轻设备的耗损。
      
　　总之，每周末小剂量重复照射建立大鼠右肺放射性肺损伤模型稳定可靠，动物死亡率低，特别是该模型更符合患者长时间、反复照射的临床放疗实际，便于动态观察放射性肺损伤的变化规律，为防治放射性肺损伤的实验研究提供可行的、科学的、实用的模型。

【】
  　　[1] Tucker SL，Liao ZX, Travis EL. Estimation of the spatial distribution of target cells for radiation pneumonitis in mouse lung[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1997, 38 (5): 1055-1066.

　　[2] Travis EL,Liao ZX,Tucker SL.Spatial heterogeneity of the volume effect for radiation pneumonotis in mouse lung[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys,1997,38 (5):1045-1054.

　　[3] Forrest LJ, Mahler PA, Vail DM, et al. Computed tomographic evaluation of radiation pneumonitis in a canine model[J]. Radiat Oncol Investig,1998,6(3):128-134.

　　[4] Wennberg B, Gagliardi G, Sundbom L,et al. Early response of lung in breast cancer irradiation: radiologic density changes measured by CT and symptomatic radiation pneumonitis[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys，2002,52(5): 1196-1206.

　　[5] Marks LB, Fan M, Clough R, et al. Radiation?induced pulmonary injury：symptomatic versus subclinical endpoint[J]. Int J Radiat Biol, 2000, 76 (4): 469-475.

　　[6] Travis EL. Sequence of histological changes in mouse lungs after single doses of X rays[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys,1980,6 (3):345-347.

　　[7] 白蕴红, 王德文, 徐在海,等. 放射性间质性肺炎病变规律及其机理研究[J]. 解放军医学杂志,1993,18(1):14 - 18.

　　[8] Chiang CS，Liu WC，Jung SM，et al．Compartmental responses after thoracic irradiation of mice：strain differences[J]．Int J Radiat Oncol Biol Phys，2005，62(3)：862-871．