膝骨关节炎患者关节液中IL?17表达水平的临床研究

                   作者：董军峰, 郑之和, 李新志, 卢国强, 曾勇

【摘要】  目的 探讨膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)患者膝关节液中IL?17表达水平。方法 用双抗体夹心ELISA法测定37例(41膝)KOA患者与24例(24膝)志愿者膝关节液中IL?17浓度并比较两组差异。将KOA患者按综合评分法分为轻(13膝)、中(19膝)、重(9膝)三组，比较三组患者膝关节液中IL?17浓度的差异。结果 KOA患者膝关节液中IL?17浓度为156.76±112.78 pg/ml，明显高于对照组31.67±18.74 pg/ml（P<0.01）。轻、中、重三组患者膝关节液中IL?17的浓度分别为50.16±24.15 pg/ml、154.63±47.39 pg/ml、314.83±105.89 pg/ml，呈现出随着病情分级逐渐加重而IL?17表达水平逐渐增高的趋势(P<0.01)。结论 IL?17作为一种前炎症细胞因子，参与了KOA疾病的诱发、触发了病理改变、加快了病情的进展。IL?17可作为判断KOA临床病情、预后的免疫学指标之一。对IL?17的研究将有助于进一步在分子水平阐明KOA的发病机制，为临床诊断和KOA提供新的思路。

【关键词】  膝骨关节炎； IL?17； 表达； ELISA

    【Abstract】  Objective To explore the expression of the IL?17 in the knee osteoarthritis(KOA) patients’ sick knee joint synovia. Methods The concencentrations of the IL?17 in the knee joint synovia were detected by two antibodies sandwich?ELISA method and compared between the 37 cases(41 knees) of the KOA patients and 24 cases(24 knees) of volunteers. The KOA patients were divided into the mild group(13 knees), the moderate group(19 knees) and the severe group(9 knees).The concentrations of the IL?17 in the knee joint synovia were compared in the three groups. Results  The concentration of the IL?17 in the sick knee joint synovia of the sick group was 156.76±112.78 pg/ml, which was significantly higher than the contrast group (31.67± 18.74 pg/ml) (P<0.01). The concentration of the sick knee joint synovia of the mild group, moderate group and severe group were 50.16 ±24.15 pg/ml, 154.63±47.39 pg/ml and 314.83± 105.89 pg/ml, respectively, which appeared agradual elevatory uptrend in the state of illness’ development(P<0.01). Conclusions IL?17 participates the KOA’s evocation, trigges the alteration in pathology, speeds up the progression of the pathogenetic condition, as a pre?inflammation factor. IL?17 can be an immunological index of judging the clinical pathogenetic conditions and prognosis for the KOA patients to offer a new idea to the diagnosis and therapy of KOA.

    【Key words】  knee osteoarthritis(KOA),Interlekin?17,expression,ELISA

     膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)是一种慢性进行性骨关节疾病,以关节软骨退行性变为主要病理特征,其早期X线征象不明显。通过检测血清、关节液或尿液中某些能间接反映关节软骨代谢状况的特异性分子,有助于判断OA 软骨病变程度、预后和评价药物疗效,有望成为KOA早期诊断的有效辅助方法。本研究采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)定量测定对照组及KOA患者关节液中IL?17（interleukin?17，IL?17）的表达水平,研究KOA病变严重程度与关节液中IL?17的关系,探讨IL?17在OA发病中所起的作用及其临床运用价值。

    1  资料与方法

    1.1  来源与选择

    研究对象全部于2007年3月至2007年12月从三峡大学第二临床医学院、宜昌市第一骨科门诊及住院部收集而得。

    KOA患者均满足下列条件：①诊断明确KOA患者：临床诊断参照1987年美国风湿病协会［1］所制订标准。X线诊断及分级参照Kellgren标准［2］，关节镜诊断参照Ogilvie?Harris［3］标准；②无风湿性关节炎、类风湿性关节炎等结缔组织疾病；③无肝肾功能不良、免疫系统疾病；④治疗前1周内未曾使用过非甾体镇痛药、糖皮质激素；⑤无药物过敏史；⑥非孕妇、哺乳期、月经期妇女；⑦既往无膝关节感染、关节结核、手术史。

    本研究中志愿者均为单纯上肢外伤患者且必须满足以下条件：①无下肢及腰部外伤且为绝对单纯上肢外伤患者；②入院前5年内无膝关节疼痛及外伤病史；③无风湿性关节炎、类风湿性关节炎等结缔组织疾病；④无肝肾功能不良、免疫系统疾病；⑤治疗前1周内未曾使用过非甾体镇痛药、糖皮质激素；⑥无药物过敏史；⑦非孕妇、哺乳期、月经期妇女；⑧既往无膝关节感染、关节结核、手术史。

    1.2  一般资料

    根据上述标准共有37例(41膝)入选，从三峡大学第二临床医学院收集到27例KOA患者，均为单膝患病；24例志愿者即单纯上肢外伤患者。从宜昌市第一医院收集到10例(14膝)KOA患者，其中双膝患病4例，单膝患病6例。37例KOA患者中男11例，均为单膝患病；女26例，4例双膝均发病。KOA患者平均年龄为44.7岁，病程4～11年，平均8.4年。24例志愿者即单纯上肢外伤组患者平均年龄39.8岁，其在年龄、体重等一般资料与KOA组进行比较（结果见表1）。

    1.3  分组方案

    根据研究的进展及要求制定了3种不同的分组方案：

    方案1  将上述37例(41膝)KOA患者和24例(24膝)志愿者直接分为病患组、对照组。表1  OA患者与对照组一般资料比较方案2  将上述入选的37例(41膝)患者按综合评分法［4］进行临床分级。即列举临床症状、体征及X线改变等5项指标，各项指标按无、轻、中、重分别计为0、1、2、3分。各项计分累加后其总分每5分为1个等级。轻≤5分、中≤10分、重≤15分(如图1、2、3)。

    1.4  指标检测

    本实验所需检测标本为KOA患者患膝关节液及志愿者膝关节液。所有实验所需关节液均严格按陈文彬［5］介绍标准行膝关节穿刺获得。所有标本在原始采集时均采用武汉致远医疗科技有限公司生产医疗专用试管盛装。所有标本均在常温、4 000r/min下离心10min后取上清夜，EP管分装后?30℃低温冰箱保存，集中待检。 本研究所采用检测原理为双抗体夹心ELISA法，检测所需IL?17试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，Batch No: 0605172, Catalog No: A0116.指标检测严格参照上述试剂盒使用说明进行。

    1.5  统计学方法

    实验数据均使用SPSS10.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示。两样本均数差别应用t检验，率的比较采用卡方检验,两两组间比较采用单因素方差分析。

    2  结果

    2.1  KOA患者关节液中IL?17表达水平

    参照分组方案一分组。本组37例患者(41膝)患膝关节液中IL?17浓度最高为416.32 pg/ml，最低为19.55 pg/ml.本组病例中病患组患膝关节液及对照组膝关节液中IL?17浓度分别为156.76±112.78 pg/ml和31.67±18.74pg/ml，KOA病患组明显高于对照组，存在显著性差异(P<0.01)，有统计学意义(见表2)。

    2.2  KOA患者关节液中IL?17表达水平与临床分级的关系

    本组37例患者41膝，参照分组方案二分组，轻13膝、中19膝、重9膝、取志愿者为对照组。3个不同临床级别KOA患者患膝关节液中IL?17浓度95%的可信区间分别为35.57～64.76pg/ml、131.79～177.47pg/ml、233.44～396.23pg/ml.

    “轻” 组较对照组无显著性差异(P>0.05),轻、中、重三组组间比较（P<0.01)，有显著性差异,结合本组病例即随着KOA病情逐渐加重，IL?17浓度呈明显递增趋势(P<0.01) (见表3)。表2  KOA病患组膝关节液与对照组膝关节 表3  KOA患者膝关节液中IL?17表达

    3  讨  论

    随着对KOA免疫学研究的不断深入，发现细胞因子在KOA中扮演着重要角色，其中最受人们关注的有IL?1、IL?6、TNF?α、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、软骨衍生生长因子(cartilage?derived growth factor,CDGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor ,HGF)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor ,PDGF)等［6］。IL?17作为一种前炎症细胞因子，既往认为其在哮喘气道高反应性过程中发挥了重要作用［7］，而最近研究表明其与KOA有着密切联系。CAI等［8］向小鼠膝关节内注入IL?17可诱发关节炎，并加重滑膜炎症和关节破坏，说明IL?17/IL?17R在关节炎症中细胞因子失衡和结缔组织重构方面起重要作用。Bush等［9］发现通过可溶性IL?17R及特异性抑制剂阻断内源性IL?17的作用，能够减轻自身免疫、胶原或佐剂诱发关节炎的关节损伤程度，减少滑膜及骨组织IL?6和I型胶原降解标志物(c?telopeptide)的释放。阿片拮抗剂、环抱霉素A及甲基强的松龙对KOA有一定治疗作用，可能与下调IL?17mRNA的表达［10］有关。

    尽管目前尚不能肯定IL?17是KOA的诱发因素，还是KOA病理改变中的产物，但可以肯定IL?17作为精细调节因子在KOA中扮演了重要角色，其与IL?17R受体结合后可能从以下多个方面参与并促进KOA的发生和:①IL?17单独或与IL? 1β,TNF?α等协同刺激关节滑膜细胞表达炎症因子如IL?6，IL?8 以及巨噬细胞炎症蛋白?3α(macrophage inflammatory protein?3α,MIP?3α)，参与和促进关节软骨的降解。Honorati等［11］发现IL?17在滑液成纤维细胞和软骨细胞中，上调IL?8的释放，同时也在一定程度上促进IL?1β的合成。②IL?17增加关节软骨细胞iNOS表达和NO产量。Attur等［12］报道IL?17在体外能通过活化核因子κB上调软骨中NO的自发性生成，这种增强作用对放线菌酮和二硫代氨基甲酸四氢吡咯敏感，对地塞米松或可溶性的IL?1R不敏感。LeGrand等［13］发现联合应用IL?17和TNF?α，较单独一种细胞因子(IL?17或TNF?α)显著增加从OA患者分离出的半月板中NO的生成。Martel?Pelletier等［14］指出在体外IL?17诱导的人OA软骨细胞中NO的增加水平与IL?17呈剂量依赖增加，并且与TNF?α是协同效应，与白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）具有叠加效应，与IL?1β联用并不比单用IL?1β强,同时IL?4、IL?10、IL?13对IL?17诱导的NO生成没有明显影响。③IL?17增强软骨细胞及滑膜成纤维细胞基质金属蛋白酶(MMP?1/3/13)的表达，增强聚蛋白多糖酶(aggrecanase)和胶原酶(collagenase)活性［8］，促进软骨蛋白多糖及胶原降解［15］；抑制软骨细胞蛋白多糖(proteoglycan，PG)的合成［16］,并可增强单核细胞对软骨基质的破坏［17］。Sylvester等［18］发现IL?17上调软骨细胞及滑膜成纤维细胞基质金属蛋白酶的表达。Benderdour等［19］报道在OA软骨细胞，IL?17诱导胶原蛋白酶?3的表达和合成，并且在10 ng/ml即达到EC50，同时指出IL?17 和IL?1β诱导胶原蛋白酶?3生成是通过AP?1对不同的蛋白质作用而发生的：IL?17刺激FosB活化，而IL?1β则刺激c?Fos活化，JunB蛋白则可能起一定的限制作用。④IL?17联合TNF?α或IL?10协同增加软骨细胞和成骨细胞PGE2的合成，上调COX?2的表达。LeGrand等［13］指出联合应用IL?1β和TNF?α对PGE2的生成有一种协同叠加作用，并且PGE2的生成与NO的生成有着一定相互影响。⑤IL?17刺激、活化滑膜细胞及巨噬细胞［15］，增强破骨细胞分化因子(osteoclast differentiation factor，ODF)基因表达，诱导破骨细胞祖细胞向成熟破骨细胞分化。Chabaud等［20］报道IL?17能够通过可溶性受体和Th2细胞因子，诱导增强RA中巨噬细胞炎症蛋白?3α生成，诱导活化巨噬细胞，IL?17可能也通过这一机制参与了在骨关节炎中病理进展。⑥IL?17能促进骨关节炎中软骨血管生成。Honorati等［21］通过分离出OA、RA和股骨或肱骨颈骨折患者(femoral or humeral neck fracture patients,FP)的软骨细胞，检测炎症前因子IL?17、IL?1β、TNF?α刺激血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)生成情况，探讨其在软骨血管生成中的作用，发现在分化的条件下，IL?1β、TNF?α能抑制人OA、RA、FP患者软骨细胞VEGF的自发性分泌，同时IL?17能修复由TNF?α导致的分泌减少，并且IL?17和IL?1β、TNF?α一起能不同程度的增强去分化的OA软骨细胞的VEGF的分泌。⑦IL?17下调血红素加氧酶 (heme oxygenase?1，HO?1)的表达。HO?1参与了一种防止组织损伤作用的一种保护性机制。Fernández等［22］用免疫方法研究软骨和在缺乏刺激因素培养的软骨细胞标本中 HO?1的表达时发现，HO?1受到细胞因子的调节，IL?1β、IL?17和TNF?α下调这种蛋白，然而抗炎症细胞因子IL?10表现出相反的效应。　　人IL?17的来源很局限，最初人们认为IL?17主要由激活的人CD4+Ｔ记忆细胞产生,后来发现CD8+细胞、嗜酸性粒细胞、TCR+CD4?CD8?的胸腺细胞、上皮细胞、血管内皮细胞等均有不同程度的表达，在佐剂诱导骨关节炎模型早期,腹股沟淋巴结及关节液中IL?17表达即已升高［23］。Kaneyama等［24］在61例骨性颞下颌关节疾病患者中有27%的患者检测到了IL?17。Ziolkowska等［25］报道在风湿性关节炎患者关节中IL?15可能代表了一种生理的触发器，通过环胞菌素A和敏感的类固醇途径导致IL?17的过量表达。

    　　本研究结果显示在KOA患者关节液中IL?17表达水平明显高于对照组(P<0.01)，本实验发现，IL?17在KOA患者患膝关节液中的表达水平与KOA的严重程度呈正相关，这提示IL?17可能作为临床病情分级及预后指标之一。但同时发现在KOA早期，其表达水平并不比对照组高，随着KOA病情进展，其水平才显著升高，因此其用于诊断早期KOA中存在假阴性。同时有报道其在类风湿关节炎患者膝关节液中亦有表达［26］，因此其在诊断上亦有假阳性，故IL?17应用于诊断KOA的特异度及灵敏度尚待进一步研究。

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