双氢青蒿素干预结直肠癌模型动物肿瘤生长的实验研究?

                 作者：战晓农 余卫华 刘恋  黄燕 王雷 赵学军 李国桥

【摘要】  【目的】　观察双氢青蒿素(DHA)对结直肠癌模型动物肿瘤生长的影响。【方法】选用SPF级BALB/c裸鼠，背部皮下接种结直肠癌LoVo细胞悬液复制结直肠癌模型;造模成功裸鼠随机分成5组：模型对照组，5?FU组(腹腔注射5?FU 20?mg·kg??-1?·d??-1?，共5?d)，DHA高、中、低剂量组(分别按120、60、30?mg·kg??-1?·d??-1?剂量灌胃给药)。14 d后，检测活体肿瘤及解剖剥离后裸瘤体积、平均瘤体质量、肿瘤生长速率和抑瘤率。【结果】后DHA各给药组及5?FU组活体肿瘤的体积及肿瘤生长速率均减少，与模型组比较差异有显著性意义(?P?<0?01);5?FU组及DHA高、中剂量组的裸瘤体积显著小于模型组(?P<0?05或P?<0?01);各给药组瘤体质量显著低于模型组(均?P?<0?05);DHA高、中剂量组的抑瘤率显著高于5?FU组(?P?<0?05)，但DHA低剂量组抑癌率显著低于5?FU组(?P?<0?05)。【结论】DHA对结直肠癌模型动物肿瘤生长具有一定的抑制作用。?

【关键词】  双氢青蒿素/药;　结肠肿瘤/中药疗法; 　直肠肿瘤/中药疗法;　疾病模型，动物;　裸鼠?

青蒿素是从黄花青蒿中提取的有效成分，为一种含内过氧化基团的倍半萜内酯化合物，临床上主要用于治疗疟疾。近年来国内外研究发现，青蒿素及其衍生物还具有其他药理活性，特别是其抗肿瘤作用受到了广泛关注。Efferth等??[1]?发现青蒿琥酯对55株肿瘤细胞具有体外抑瘤作用，青蒿琥酯对结直肠癌细胞株的半数抑制浓度(IC??50?)为(2?13±0?74)μmol/L，而且对白血病等细胞株均有效果。周从明等??[2]?用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测青蒿琥酯对人结直肠癌细胞株(HCT?8)的杀伤作用，结果发现青蒿琥酯对HCT?8的IC??50?值为1?99 μg/mL。青蒿素类药物的抗疟作用主要因其具有独特的过氧桥结构，可以被铁裂解产生大量的自由基，进而形成一些亲化合物，攻击细胞膜或细胞内其他膜性结构，改变了细胞的通透性??[3]?。至于青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用机制，很多研究者??[4-5]?认为与青蒿素类药物的抗疟机制和肿瘤细胞代谢的特点有关，青蒿素类药物具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制新生血管等作用 。为进一步探讨双氢青蒿素的抗癌活性，本研究观察了其对结直肠癌细胞株荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响，现报道?如下。　　　??

　　1　材料与方法?

　　1?1　细胞株　结直肠癌细胞株LoVo由南方医科大附属南方消化病研究所提供。?

　　1?2　实验动物　SPF级健康BALB/c雌性裸鼠50只，出生4～6周，体质量20～25?g，由中科院上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：SCXK(沪)2007?0005;SPF环境下饲养。 ?

　　1?3　药物　双氢青蒿素片(DHA)由四川三奇制药有限责任公司生产，批号：071001，以羧甲基纤维素钠作为助溶剂溶解，再取定量混合液加入双氢青蒿素，分别配置成30、60、120?g/mL;阳性对照药5?氟尿嘧啶(5?FU)注射液由上海旭东制药厂提供，批号：080708，以生理盐水配置成20??mg/mL?，冷藏备用。?

　　1?4　动物造模??[6-7]?、分组及给药　在SPF级实验室无菌环境下，将培养成功的结直肠癌LoVo细胞以胰酶消化后，配置成细胞悬液，细胞浓度为2×10?6个/mL。取细胞悬液0?5?mL，以无菌针管于裸鼠右背部皮下接种，接种工作在30?min内完成，定期观察肿瘤接种情况，9 d后所有皮下瘤块长至0?6~0?8?cm时，表示动物肿瘤造模成功。再随机分为5组，每组10只，各组标记后称体质量记录。模型对照组灌胃生理盐水0?2?mL/d，共14 d;5?FU组腹腔注射5?FU 20?mg·kg??-1?·d??-1?，共5 d，此后灌胃生理盐水0?2?mL/d，直至14?d;DHA高、中、低剂量组分别按120、60、30?mg·kg??-1?·d??-1?剂量灌胃DHA溶液，连续14?d。末次给药后第2天以颈椎脱臼法处死并解剖动物。?

　　1?5　观察指标　在实验过程中及在处死动物后，均用游标卡尺测量活体肿瘤、解剖剥离后所得裸瘤的最大直径?a和横径b，按公式V=π/6×a×b?2?活体肿瘤及裸瘤的体积。用?V???GR?〔?V???GR?=(?V?1-V?0)/t???病程?，mm?3/d〕比较活体肿瘤的生长速率，其中?V?1为给药后活体肿瘤体积大小，V?0?为造模成功当日活体肿瘤体积大小;并计算抑瘤率：?p??抑瘤?=[1-(m??给药组?/m??模型组?)]×100?%，其中m??给药组?为给药组平均裸瘤质量，m???模型组?为模型对照组平均裸瘤质量。?

　　1?6　统计学方法　所有实验数据采用SPSS 13?0统计软件进行分析。?

　　2　结果?

　　2?1　各组对结直肠癌细胞株荷瘤裸鼠活体肿瘤体积及其生长速率的影响

　　表1结果显示，造模成功时，各组裸鼠的活体肿瘤体积无显著性差异(?P?>0?05);实验结束时，DHA各给药组和5?FU组活体肿瘤的体积及肿瘤生长速率均无显著性差异(?P>0?05)，但与模型组比较差异均有显著性意义(P?<0?01)。?

　　2?2　各组对结直肠癌细胞株荷瘤裸鼠裸瘤体积及其抑瘤率的影响　表2结果显示，实验结束时，5?FU组及DHA高、中剂量组的裸瘤体积均显著小于模型组(?P<0?05或P<0?01)，但各给药组的裸瘤体积组间无显著性差异(P>0?05);各组药组平均瘤体质量均显著小于模型组(均P?<0?05)，且DHA高、中剂量组的抑瘤率显著高于5?FU组(?P?<0?05)，但低剂量DHA组的抑瘤率显著低于5?FU组?(P?<0?05)。　表1　各组对结直肠癌细胞株荷瘤裸鼠活体肿瘤体积及其生长速率的影响表2　双氢青蒿素对结直肠癌细胞株荷瘤裸?鼠裸瘤体积及抑瘤率的影响统计方法：方差分析;①?P<0?05，②P<0?01，与模型组比较;③P?<0?05，与5?FU组比较??

　　3　讨论?

　　当前结直肠癌的化疗药物大多具有较强的毒副作用，从传统中药以及天然药物中开发新的高效低毒的抗癌物质已经成为研究热点。体内抑瘤实验结果是评价抗肿瘤药物有效性的重要指标，其中移植性动物肿瘤模型具有接种成功率高、实验周期短、重复性好等优点。所以本研究选用免疫功能缺乏的裸鼠接种人结直肠癌LoVo细胞进行造模，从而观察双氢青蒿素的抗结直肠癌活性。结果发现给药后DHA各剂量组以及5?FU组的瘤块体积以及质量显著低于模型对照组，差异有显著性意义(?P<0?05或P?<0?01)，DHA高、中剂量组的抑瘤率均显著高于5?FU组(?P?<0?05)。提示DHA对结直肠癌模型动物肿瘤生长具有一定的抑制作用，为开发新的治疗结直肠癌化疗药物奠定了基础，并且对于广泛挖掘青蒿素及其衍生物的药理活性具有重要意义。双氢青蒿素的抗癌活性及其机制还有待进一步的探索

【】
  　　[1] Efferth T，Dunstan H，Sauerbrey A，et a1?The anti?malarial artesunate is also active against cancer[J]?International Journal of Oncology，2001，18(4):767??

　　[2] 周从明，王小渝，吴康玉，等?青蒿琥酯的抗肿瘤作用研究[J]?四川肿瘤防治，2006，19(2):89??

　　[3] Singh N P，Lai H?Selective toxicity of dihydroartemisinin and holotransferrin toward human breast cencer cells[J]. Life Sci， 2001，70(1)：49??

　　[4]李菌，周慧君?二氢青蒿素抑制K562细胞血管内皮生长因子的表达[J]?药学学报，2005，40(11)：1041??

　　[5] Chen H H， Zhou H J， Wu G D， et al? Inhibitory effects of artesunate on angiogenesis and on expressions of vascular endothelial growth factor and VEGF receptor KDR/flk?1 [J]?Pharmaco1，2004，71(1)：1??

　　[6] 吴细丕，钱林法? 实验动物与肿瘤研究 [M]?北京：医药科技出版社，2006：116??

　　[7] 魏泓? 医学实验动物学 [M]? 成都：四川技术出版社，1998：423?