针刺对乳腺增生模型大鼠雌激素、雌激素受体及其信号传导的干预作用

【摘要】  【目的】观察针刺对雌激素介导的乳腺增生模型大鼠的影响。【方法】选用SD雌性未孕大鼠，随机分为4组：正常组、模型组、针刺组(电针膻中、三阴交穴)、西药组(灌胃三苯氧胺0?5?mg·kg??-1?·d??-1?);除正常组外，其他组均采用肌注己烯雌酚(剂量为0?5?mg·kg??-1?·d??-1?)及黄体酮(剂量为4?mg·kg??-1?·d??-1?)方法复制乳腺增生模型;造模成功后针刺组及西药组30?d，采集标本，检测各组大鼠体质量，第2对乳头高度，血清雌激素(E?2)水平，雌激素受体(ER)、细胞外信号调节激酶(ERK)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达及乳腺组织形态学变化。【结果】各组大鼠治疗前后体质量、治疗前乳头高度差异无显著性意义(均?P>0?05)，治疗后模型组乳头高度显著增加(P﹤0?01)，各治疗组可显著降低乳头高度(均P﹤0?05);模型组出现明显乳腺增生形态学改变，各治疗组可显著减少乳腺小叶腺泡数、腺泡腔直径及导管直径(均P﹤0?05或P?﹤0?01);模型组大鼠血清E?2水平，乳腺组织ER、ERK、eNOS蛋白表达阳性细胞数显著增加(均?P﹤0?01)，各治疗组可显著降低上述指标(P﹤0?05或P?﹤0?01)。【结论】针刺治疗乳腺增生的作用可能与其能调节雌激素信号转导通路，抑制雌激素的促乳腺增生效应有关。?

【关键词】  乳腺增生/针灸疗法;　雌激素/血液;　乳腺/病;　信号转导通路;　疾病模型，动物;　大鼠?

雌激素作为一种重要的女性激素，在乳腺的生理病理过程中有着十分重要的作用。乳腺增生具有明显的雌激素依赖性。雌激素能刺激乳腺组织增生，引起乳腺导管扩张和囊肿形成，是影响乳腺增生发生、及转归的重要因素??[1-2]?。雌激素通过靶组织中的雌激素受体发挥其生物学效应，在这一过程中雌激素信号转导机制起着关键性的作用??[3]?。本实验观察了针刺对雌激素介导的乳腺增生模型大鼠雌激素(E?2)水平，雌激素受体(ER)、细胞外信号调节激酶(ERK)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响。现报道如下。?

　　1　材料与方法?

　　1?1　 实验动物　选用清洁级SD雌性未孕健康大鼠40只，体质量220~240?g，鼠龄3个月，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SCXK(粤)2003?0001。饲养环境：广州中医药大学实验动物中心提供的清洁级动物实验房，动物实验设施使用编号：0005042。?

　　1?2　药物和试剂与仪器　己烯雌酚注射液(广州明兴制药厂生产，批号：103149);黄体酮注射液(上海通用药业股份有限公司生产，批号：H31021401);三苯氧胺(TAM，上海华联制药有限公司生产，批号：H10910072);苏木素(广州化学试剂厂生产，批号：20050918);伊红(南京化学试剂厂生产，批号：20051809);E?2试剂盒由北京东雅生物技术有限公司提供(批号：20050625)，检测仪器为上海日环仪器一厂SN?695B型放免测量仪;ER、ERK、eNOS抗体及免疫组化试剂盒购自中山生物试剂有限公司广州分公司，ER、ERK、eNOS一抗工作浓度为1∶100;二抗、三抗、联苯二胺(DAB)工作液购自武汉博士德公司;日本Olympus显微镜;北京航空航天大学图像分析软件(2?4版本)。?

　　1?3　造模方法??[4]?　 大鼠大腿内侧肌注己烯雌酚注射液 ?0?5?mg·kg??-1?·d??-1??，连续25?d，继而改用肌注黄体酮4?mg·kg??-1?·d??-1?，连续5?d。?

　　1?4　分组　40只大鼠随机选取10只作为正常组，其他30只造模成功后随机分为模型组、针刺组和西药组。正常组在实验的后半段以蒸馏水灌胃?2?mL/d;?模型组造模成功后以蒸馏水灌胃，针刺组造模成功后进行针刺治疗，西药组造模成功后灌胃三苯氧胺 ?0?5?mg·kg??-1?·d??-1??，均30?d。?

　　1?5　针刺方法　取穴：膻中、三阴交穴。参照《实验针灸学》??[5]?，膻中定位：胸骨正中线上平第4~5肋间隙;三阴交定位：后肢内踝尖直上?10?mm?处。刺法：以1寸毫针，斜刺膻中穴，留针?15?min;?直刺双侧三阴交穴，加电，疏密波，强度以肌肉轻微抖动为度，时间持续15?min，每天1次，共30?d。?

　　1?6　标本采集及检测项目?

　　1?6?1　乳头高度测量　用精密油标卡尺测定治疗前后大鼠第2对乳头高度。?

　　1?6?2　血清E?2水平检测　实验结束后断头采血，血样经离心(2 000?г/min×15?min)，取血清，低温保存(-20?℃)。采用放射免疫法测定。?

　　1?6?3　组织形态学　于实验结束后处死动物，取大鼠第2对乳腺标本，体积分数10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片。苏木素—伊红(HE)染色，在光镜下观察组织学表现，并测定乳腺腺泡数、腺泡腔直径及导管直径。?

　　1?6?4　ER、ERK、eNOS表达检测　采用免疫组化法检测，各组每只动物取相同序号的5张切片。阳性细胞评定标准：细胞浆和(或)核内有棕黄色细颗粒者为受体阳性细胞，表示该细胞有相应蛋白表达。每张切片随机选取5个高倍镜视野(400倍)，计数每个高倍镜下阳性细胞数，并以5个视野的平均值表示。?

　　1?7　统计学方法　采用SPSS 11?0统计软件分析数据，采用单因素方差分析：方差齐时采用LSD法(最小显著差异法);方差不齐时采用Dunnett T3法。方差分析齐性检验水平?α?1=0?05， 显著性检验水平α??2=0?05。组内治疗前后比较采用?t?检验。?

　　2　结果?

　　2?1　各组大鼠体质量及乳头高度比较　表1结果显示，各组大鼠治疗前后体质量及治疗前乳头高度比较，差异无显著性意义(均?P>0?05);治疗后模型组乳头高度显著增加(P﹤0?01)，针刺组及西药组乳头高度显著降低(均P?﹤0?05)。表1 各组大鼠体质量及乳头高度比较统计方法：方差分析;①?P<0?01，与正常组比较;②P?<0?05，与模型组比较??

　　2?2　各组大鼠乳腺组织形态学比较　正常组乳腺导管上皮细胞排列规则，导管腔、腺泡腔无扩张，小叶及小叶中腺泡数极少。模型组乳腺导管上皮细胞排列紊乱，上皮增生明显，局部呈不规则突起，导管腔、腺泡腔明显扩张，内有脱落的上皮细胞及分泌物，小叶明显增多，腺泡数明显增加，间质纤维结缔组织明显增生，表明造模成功。针刺组和西药组乳腺导管上皮排列基本规则，与模型组比较，管腔扩张减轻，差异有显著性意义( ?P<0?01);腺泡腔直径及小叶腺泡数显著减少(均P﹤0?05或P?﹤0?01)，纤维结缔组织增生亦明显减轻。结果见表2、图1(彩图页第515页)。?表2　各组大鼠乳腺小叶腺泡数、腺泡腔直径及?导管直径比较统计方法：方差分析;①?P<0?05，②P?<0?01，与模型组比较?

　　2?3　各组大鼠血清E?2水平比较　表3结果显示，模型组血清E?2水平升高，与正常组比较差异有显著性意义(?P?<0?01);针刺组、西药组血清E?2水平下降(与模型组比较，?P?<0?05)。?3　各组大鼠血清E?2水平比较　统计方法：方差分析;①?P<0?01，与正常组比较;②P?<0?05，与模型组比较

　　　2?4　各组大鼠乳腺组织ER、ERK、eNOS蛋白表达比较　模型组ER、ERK、eNOS蛋白表达阳性细胞数显著增加(均?P?﹤0?01);针刺组、西药组可显著降低ER、ERK、eNOS蛋白表达阳性细胞数(均?P?﹤0?01)。结果见表4、图2~图4(彩图页第515页)。?表4　各组大鼠乳腺组织ER、ERK、eNOS 蛋白表达比较统计方法：方差分析;①?P<0?01，与正常组比较;②P?<0?01，与模型组比较?

　　3　讨论 ?

　　SD大鼠对性激素感受性高，本研究采用肌注己烯雌酚注射液和少量黄体酮以诱导SD大鼠乳腺组织增生，造模后动物的乳腺增生呈多种类型，与人类乳腺增生病变基本一致，是目前最理想的动物乳腺增生模型??[4-6]?。在本实验中，模型组大鼠均出现乳腺增生病理改变，正常组大鼠乳腺组织未发现增生性变化，说明造模成功。?

　　中医学认为，乳腺增生病以肝肾不足，冲任失调为本，气滞、痰凝、血瘀为标，故治以疏肝理气，化痰散瘀，调和冲任。膻中穴属任脉，为气之会，心包之募，功能理气解郁化痰，疏调局部经气，行气活血。三阴交穴属足太阴脾经，为肝脾肾三阴经的交会穴，可健脾、疏肝、益肾，是调和冲任的要穴。两穴为临床乳腺增生病的基本主穴。电针疏密波能促进气血循环，改善组织营养，消除炎性水肿，有利于促进增生的乳腺组织复旧，故实验中选择疏密波。本实验结果表明针刺对雌激素过度刺激所诱导的大鼠乳腺组织增生有抑制作用，与报道相一致??[7-8]?。?

　　乳腺增生具有明显的雌激素依赖性。利用人正常乳腺组织植入裸鼠模型，给予一定量雌二醇，可引起乳腺上皮细胞增生??[2]?。本实验结果表明模型组大鼠血清E?2水平显著高于正常组，而针刺组和西药组则显著低于模型组，表明针刺膻中、三阴交穴能降低外源性雌二醇所致的血清高雌激素水平，从而提示针刺的治疗作用与调整机体血清E?2水平有关。这与临床观察到针刺对乳腺增生病患者血清激素水平有良好调整作用是一致的??[9]?。?

　　机体内雌激素的最终效应不仅取决于其本身的分泌与代谢，还与ER的表达与功能密切相关。良性乳腺疾病肿块组织内的ER阳性率高于正常乳腺组织，但较恶性肿瘤低，随着增生程度的加重，其ER的阳性强度有明显增加的趋势??[10]?。乳腺增生病的发病除了过高的雌激素直接刺激乳腺组织外，局部乳腺组织ER增加，致使组织对雌激素的敏感性增强也是另一个重要的发病原因??[11-12]?。在本实验中，针刺组的ER受体阳性细胞数显著低于模型组?(?P?<0?01)?，提示针刺膻中、三阴交穴可抑制ER表达，从而下调雌激素对乳腺的作用，抑制乳腺增生。?

　　雌激素信号转导机制在雌激素的生物学效应中起着关键性作用。目前认为雌激素效应机制有经典的基因组效应和非基因组效应两种，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径为产生非基因组效应原因之一??【3，13】?。MAPK途径是与细胞增殖、分化或凋亡调控密切相关的细胞信号转导途径，是细胞外信号引起细胞增殖、分化等反应的共同途径或汇聚点，参与细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理过程。目前，MAPK家族的信号通路包括4条途径，细胞外信号调节激酶(ERK)为其中之一??[14]?。ERK可被多种生长因子、细胞因子激活，介导细胞增殖信号的传导。ERK是受外界刺激时决定细胞命运的关键因素，它能促进增殖，决定细胞向终末分化或发生凋亡??[15]?。ERK的过度表达及激活，可能与人乳腺癌的发生、相关，化疗药物(环磷酰胺、表阿霉素)可能是通过抑制ERK蛋白的过度表达及活化来抑制乳腺癌细胞的增殖??[16]?。因此，通过干预MAPK信号通路的转导过程或强度，可有效调控肿瘤细胞的增殖分化，对阻止乳腺增生病癌前期病变的演变有重要意义。本实验中，针刺组ERK蛋白表达水平显著低于模型组(?P?﹤0?01)，提示针刺膻中、三阴交穴有抑制ERK表达的作用。针刺是否能通过ERK通路，从而下调雌激素对乳腺组织细胞增殖、分化及血管扩张等生物学效应，达到抑制乳腺增生的作用，有待进一步研究。?

　　一氧化氮(NO)是人体内细胞间信息传递的重要调节因子，参与多种疾病的病理生理过程。雌激素可通过雌激素膜受体快速激活eNOS，MAPK通路是雌激素激活eNOS的信号转导通路之一??[17]?。本实验中，过量雌激素诱发的大鼠乳腺增生组织中eNOS蛋白表达升高，针刺组和西药组eNOS蛋白表达显著降低。提示针刺可调节过量雌激素诱发的大鼠乳腺增生组织中eNOS蛋白表达，这可能有利于保护乳腺组织，阻断增生的病理发展进程。?

　　综上所述，我们认为针刺对雌激素水平、雌激素受体及其信号转导机制具有良性调节作用，推测针刺可能通过对雌激素信号转导通路产生影响，从而抑制雌激素的促乳腺增生效应。??

【文献】
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