β?细辛醚对缺血-再灌注损伤心肌细胞的保护作用
作者：吴启端 王绮雯 陈奕芝 吴雪茹 何玉萍
【摘要】 [目的] 观察石菖蒲有效成分β?细辛醚对缺血-再灌注损伤(MI?RI)心肌细胞的保护作用。[方法]培养原代乳鼠心肌细胞，采用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)复制心肌细胞MI?RI模型，以四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞存活率，紫外分光光度法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的含量，利用流式细胞术(FCM)检测线粒体膜电位(MMP)平均荧光强度。[结果]β?细辛醚能显著提高MI?RI模型细胞存活率，降低培养液中LDH、CK的含量，提高MMP值(均P<0.05)。[结论]β?细辛醚对MI?RI心肌细胞具有保护作用，其作用机理可能与减轻细胞膜损伤，降低线粒体膜通透性有关。
【关键词】 β 细辛醚/药 缺血-再灌注损伤/中药疗法 心肌细胞/病理学 细胞培养
石菖蒲是心脑血管病的常用药，前期研究表明石菖蒲挥发油对心脑血管系统有明显的保护作用，β?细辛醚是挥发油中含量最高的主要有效成分，具有抗缺氧、抗心肌缺血、改善血液流变性和血小板聚集性、降血脂[1-3] 、扩张冠状动脉[4]等多种药理作用。本研究采用原代培养乳鼠心肌细胞观察β?细辛醚对缺血-再灌注损伤(MI?RI)心肌细胞的保护作用并探讨其作用机理。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 药品和试剂 β?细辛醚由石菖蒲挥发油精制而成〔经气-质联用(GC?MS)检测纯度为99.44%)〕，广州中医药大学第一附属实验中心提供，临用前用吐温?80、甘油助溶配成溶液使用;连二亚硫酸钠(天津市福晨化学试剂厂);2.5g/L胰酶、高糖DMEM粉剂培养基(GIBCO公司);新生牛血清(TBD公司);5??溴?2??脱氧尿苷(Brdu)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司);四甲基偶氮唑盐(MTT，广州威佳科技有限公司);罗丹明123(ALEXIS CORPORATION公司);乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.2 动物 出生24h以内的SD乳鼠由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：0020686、0020567。
1.3 主要仪器 5400型CO2培养箱(美国NAPCO公司);LX50/LX70型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);BIO?RAD550型酶标仪(日本);6010型紫外/可见分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司);ALTRA型流式细胞仪(美国BECKMAN COULTE公司，配套EXPO32采集分析软件)。
1.4 乳鼠心肌细胞的分离培养 取出生24h以内的SD乳鼠，体积分数75%酒精消毒后，取出心脏，用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)反复清洗3次，剪成3mm3大小的块状，放入小瓶子中，加入2.5g/L胰蛋白酶，4℃放置16h。取出，小心去除胰酶，重新加入2.5g/L胰酶，37℃放置20min，DISEASE MODELS，ANIMAL; MICE 加入含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养基终止消化，用吸管轻轻吹打至组织完全散开。100目钢筛过滤细胞悬液，滤液收集于10mL刻度离心管中，离心去上清。细胞接种于培养瓶中，置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。2h后以差速贴壁分离法纯化细胞，然后按1×106个/mL的浓度接种于培养板中。置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，每24h更换1次培养液，前3d加入溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)抑制成纤维细胞分裂增生，培养3～5d待实验。
1.5 实验分组及MI?RI模型制备 实验分为6组：正常对照组心肌细胞不做任何处理，按正常条件培养;MI?RI模型组将细胞按照模型制备方法处理;给药组(β?细辛醚高、中、低剂量组)心肌细胞再灌注时将"缺血"液换成含β?细辛醚(终浓度分别为25、12.5、6.25μg/mL)的培养液作用18h;基质组心肌细胞再灌注时将"缺血"液换成含基质(吐温?80、甘油)的培养液作用18h。
模型制备[5]:采用PBS+化学缺氧剂(Na2S2O4)复制"缺血"模型。配制终浓度为1mmol/LNa2S2O4的PBS液为"缺血"溶液(临用时配制，避光)。造模时将正常的细胞培养液换成"缺血"液，CO2培养箱中孵育2h，造成细胞"缺血"。再将"缺血"液换成正常培养液孵育18h，造成再灌注损伤，之后立即收集细胞进行相关实验。
1.6 细胞形态学观察 用倒置显微镜观察心肌细胞生长及病变情况。
1.7 MTT法检测MI?RI心肌细胞存活率 心肌细胞悬液接种到96 孔板，每孔100μL，待细胞贴壁后，按1.5方法分组及处理后，每孔加入10μL MTT (5g/L) ，置37℃、体积分数5%CO2培养箱作用4h，小心吸细胞上清液，加入150μLDMSO裂解，置微量振荡器振荡10min，待孔内颗粒完全溶解后，在酶联免疫仪上于570nm波长处测定各孔吸光度(D)。
1.8 培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的含量测定 将心肌细胞悬液接种到24孔板，每孔1mL，待细胞贴壁后，按1.5方法分组及处理后，取其培养液，根据试剂盒操作步骤测定LDH、CK的含量。
1.9 流式细胞术(FCM)检测线粒体膜电位(MMP) 心肌细胞接种于24孔板，每孔1mL，待细胞贴壁后，按1.5方法分组及处理，最后移去培养液，用2.5g/L胰酶消化收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清，加入终浓度为1μmol/mL罗丹明123(Rh 123)，37℃共同孵育30min后，PBS洗细胞2次，再用PBS重悬细胞，流式细胞仪检测分析MMP变化，结果以平均荧光强度(I)表示。
1.10 统计学方法 采用SPSS 11.0软件包分析。
2 结果
2.1 各组心肌细胞形态学观察 刚分离的细胞由于生物酶及机械作用的破坏，存在不同程度的皱缩，心肌细胞在贴壁之前呈圆形，培养4h后细胞开始贴壁生长，呈圆形，后伸出伪足变成菱形、多角形、宽梭形等形状。12h细胞基本贴壁，少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动，搏动的频率、节律不同。第3天细胞伸出的伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，呈放射状排列的同心圆状，搏动呈同步性，收缩明显而有力，形成所谓功能性合体细胞，搏动频率多在40～110次/min(图1-a)。模型组心肌细胞形态明显改变，细胞皱缩，胞浆颗粒增加，表面微突起减少或消失，而这些突起与心肌细胞间连接有关，特别与冲动传导、搏动同步化的形成有关，这种改变加上细胞能量缺乏，出现搏动功能下降，频率低、不规则的搏动增加或搏动停止(图1-b)。基质组的细胞形态与模型组相似，说明助溶基质在形态学方面对心肌细胞无明显影响(图1-c)。β?细辛醚高、中、低剂量组可不同程度减轻MI?RI心肌细胞的病变，足突尚存，但细胞体积稍小于正常对照组(图1-d、e、f)。
2.2 β?细辛醚对MI?RI心肌细胞的存活率及LDH、CK的影响 表1结果显示，心肌细胞造模后，吸光度降低，与正常对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)，说明模型组细胞存活率显著下降;同时培养液中LDH、CK含量显著升高(P<0.05)，表明细胞膜损伤，心肌酶外漏。模型组与基质组比较，吸光度和LDH、CK含量差异均无显著性意义(P>0.05)，说明基质对MI?RI心肌细胞存活率和LDH、CK含量无显著影响。与模型组、基质组比较，β?细辛醚高、中、低剂量组可显著提高MI?RI心肌细胞的存活率(除高剂量组外，均P<0.05)，降低培养液中LDH、CK的含量(除低剂量组LDH外，均P<0.05)，表明β?细辛醚对MI?RI心肌细胞具有一定的保护作用，但3个剂量组间不存在量效关系。表1 各组对MI?RI心肌细胞的存活率及LDH、CK含量变化比较统计方法：单因素方差分析;①P<0.05，与正常对照组比较;②P<0.05，与模型组比较;③P<0.05，与基质组比较
2.3 各组对MI?RI心肌细胞MMP值的影响 表2结果表明，MI?RI心肌细胞的MMP值显著降低，与正常对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)。模型组与基质组比较，基质组的MMP值显著降低(P<0.05)，可能是基质对MI?RI心肌细胞的MMP检测比较敏感。表2 β?细辛醚对MI?RI心肌细胞MMP值的影响
统计方法：单因素方差分析;①P<0.05，与正常对照组比较;②P<0.05，与模型组比较;③P<0.05，与基质组比较
与基质组比较，β?细辛醚高、中、低剂量组能显著提高MI?RI心肌细胞的MMP值(均P<0.05)，表明β?细辛醚对MI?RI心肌细胞线粒体膜电位具有稳定作用。但3个剂量组间不存在量效关系。
3 讨论
乳鼠心肌组织经胰酶消化下来的细胞除了心肌细胞，还有很多非心肌细胞(主要是成纤维细胞和内皮细胞)。因此，原代培养的关键是尽量去除非心肌细胞，保证心肌细胞的纯度[6]。本实验采用差速贴壁的方法纯化心肌细胞，同时在心肌细胞培养前3d加入BrdU [7～10]抑制非心肌细胞的生长，从而保证心肌细胞的纯度，经鉴定纯度达95%。
心肌缺血-再灌注损伤是指在短时间心肌血供中断，一定时间内恢复血供，原缺血心肌发生较血供恢复前更严重的损伤[11]。这是目前临床上心血管病难以避免的常见并发症。
在细胞水平的研究中，常以乳鼠心肌细胞缺氧-复氧模拟在体MI?RI。Na2S2O4是一种氧清除剂,它能迅速清除融入培养液中的氧，造成心肌细胞缺氧，但又不会损伤细胞膜;缺氧后换液，洗去Na2S2O4后即造成复氧[12-14]。本研究选用1mmol/LNa2S2O4的PBS液造成心肌细胞"缺血性"损伤后，换正常培养液即成再灌注损伤，相关指标表明本模型符合MI?RI特点。
心脏是血液循环的动力器官，几乎完全依赖有氧代谢提供能量，因此心肌细胞对缺氧极为敏感[15]。心肌细胞缺氧-复氧后引起损伤的机制与氧自由基的释放、钙超载、细胞死亡和凋亡等有关[16]。心肌细胞的缺血性损伤是一个动态的过程，若缺血状态持续或恶化，心肌细胞的缺血性损伤继续发展，细胞内Ca2+ 超载和氧自由基引发的膜损伤不断加剧，膜破坏至心肌酶漏出，最终导致细胞的不可逆损伤，发生细胞坏死。MTT可以反映活细胞及琥珀酸呼吸链的状态，间接地反映细胞的存活率，而心肌酶含量的变化是反映心肌坏死的重要指标[17]，也是细胞膜完整性的生化标准[18]，测定细胞培养液中心肌酶(LDH、CK)的水平能反映细胞损伤的程度。本研究结果表明，β?细辛醚能提高MI?RI心肌细胞的存活率，减轻MI?RI细胞膜的损伤，降低LDH、CK的外漏，从而有效地保护心肌细胞膜的结构和功能。
心肌细胞中富含线粒体，是细胞能量代谢的场所和参与细胞凋亡的重要细胞器。它消耗细胞内大多数的氧用于氧化磷酸化生成三磷酸腺苷(ATP)，为细胞的各项活动提供能量。而MMP是细胞能量产生的先决条件，它的大小直接反映线粒体功能和数量[19]。细胞受损后，线粒体膜通透性增加，MMP值降低。本研究结果表明，β?细辛醚能提高MMP值，提示β?细辛醚对MI?RI心肌细胞的线粒体膜具有稳定作用。
由此可见，β?细辛醚对Na2S2O4造成的MI?RI心肌细胞具有一定的保护作用，其作用机制可能是通过减轻缺血-再灌注损伤心肌细胞的细胞膜损伤，降低线粒体膜通透性来完成的。
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