强磁重力环境对成骨细胞增殖、形态及其主要元素含量的影响

                作者：骞爱荣，张维，瓮媛媛，杨鹏飞，王哲，商澎

【摘要】  目的： 研究强磁重力环境(HMGE)对成骨细胞增殖、形态以及主要元素相对百分含量的影响. 方法： 采用大梯度超导磁体模拟空间重力环境，以细胞计数法和扫描显微镜结合能谱仪(SEM?EDS)分别检测强磁失重（0 g），强磁常重力（1 g）和强磁超重力（2 g）三种HMGE对人骨肉瘤细胞(MG?63)及小鼠成骨样细胞(MC3T3)增殖能力、形态以及细胞中钙、钠、镁等元素百分含量的影响. 结果： MG?63和MC3T3细胞在0，1，2 g和对照环境中培养24 h后，MC3T3细胞平均增殖倍数分别为：-（0.21±0.06），0.91±0.17，0.49±0.04和1.08±0.18；MG?63细胞平均增殖倍数分别为：1.03±0.16，0.75±0.06，0.67±0.15和0.44±0.07. 与对照组相比较，0，1，2 g环境处理组细胞形态发生明显变化，其中0 g环境处理组变化最为明显. 各环境处理组MC3T3细胞中钙、钠、镁元素百分含量与对照组相比差异不明显. MG?63细胞中钙元素百分含量0，1，2 g环境处理组及对照组分别为(9.93±0.98)%，(3.61±1.53)%，(5.30±1.47)%和(7.35±1.92)%，与对照组相比，0 g环境处理组MG?63细胞中钙元素含量明显增加（P<0.01），而1，2 g环境处理组MG?63细胞中钙元素含量明显下降（P<0.05）. 各组MG?63细胞中钠元素含量与对照组相比较差异不明显. MG?63细胞中镁元素百分含量0，1，2 g环境处理组及对照组分别为：0%，(1.90±0.77)%，(2.50±0.74)%和(2.83±0.21)%. 0，1 g环境处理组与对照组相比明显下降（P<0.05）. 结论： HMGE可影响成骨细胞的增殖、形态以及细胞中钠、镁、钙等元素的相对百分含量.

【关键词】  强磁重力环境；增殖；扫描电镜；X射线能谱分析；元素；成骨细胞

     0引言

    大梯度强磁场产生的强磁重力环境（high magneto?gravitational environment，HMGE）是一种全新的人工极端环境. 研究［1-2］表明，强磁悬浮可改变青蛙卵的卵裂面并使有丝分裂器再定向，影响酵母细胞的增殖、周期及基因表达［3-4］. Glade等［5］采用磁悬浮技术研究微管自组装，但有关HMGE对哺乳动物细胞形态功能的影响研究还少见报道. 目前对强磁场的研究，也多为非梯度恒稳强磁场，且没有重力效应. 本研究通过开展HMGE对细胞增殖及其增殖过程中对钙、钠、镁等元素百分含量的影响研究，可为极端环境生物学研究奠定理论基础，也为空间生命研究的地基模拟实验提供一种可供选择的新手段.

    1材料和方法

    1.1材料人成骨肉瘤细胞MG?63（科学院上海细胞库）；小鼠成骨样细胞MC3T3（中国医学科学院基础所细胞库）；MEM培养基及胎牛血清（美国Hyclone公司）；胰蛋白酶及台盼蓝（华美生物工程公司）；35 mm细胞培养皿（美国Costar公司）；S?3400N扫描电子显微镜（日本Hitachi公司，第四军医大学提供）；X射线能谱仪（英国牛津公司，第四军医大学提供）；JMTA?16T50MF大梯度强磁场的超导磁体及其辅助设备［6］（日本JASTEC公司）.

    1.2方法

    1.2.1超导磁体该磁体可提供0，1，2 g三种不同重力水平. 0，1，2 g不同重力水平所对应的磁感应强度分别为12T，16T和12T. 本研究设计了0 g（0 g，12T）环境处理组，1 g（1 g，16T）环境处理组，2 g（2 g，12T）环境处理组和对照组（1 g, 地磁场）.

    1.2.2细胞培养将对数生长期的细胞（5×108/L）接种于35 mm细胞培养皿或将盖玻片粘于细胞培养皿底部，MEM培养基，100 mL/L胎牛血清，37℃，50 mL/L CO2培养18 h, 更换新鲜细胞培养液后，分别放置到超导磁体腔室中及正常条件下，37℃，50 mL/L CO2培养24 h.

    1.2.3细胞增殖能力检测细胞在超导磁体腔室中不同重力位置培养24 h后，将培养皿从超导磁体腔室中取出，戊二醛洗涤3次，加入2.5 mL/L胰蛋白酶消化细胞，1000 r/min，离心5 min，用台盼蓝检测细胞的存活率；用血球计数板计数各组细胞数，与接种细胞数目相比较，按公式细胞平均增殖倍数. 增殖倍数=(处理后细胞数目-接种细胞数目)/接种细胞数目，重复3次以上.

    1.2.4扫描电镜－能谱仪（SEM?EDS）检测细胞形态及能谱变化MG?63及MC3T3细胞在超导磁体腔室中不同重力位置培养24 h后，将长有细胞的盖玻片从培养皿中取出，戊二醛洗涤2次，加入30 mL/L戊二醛固定30 min；采用500，700，800，950，1000 mL/L乙醇进行梯度脱水；真空冷冻干燥仪干燥5 h；将样品抽真空后，放入离子束溅射镀膜仪30 min，进行镀膜. 样品制备好后，采用扫描电子微镜观察细胞形态，选定区域，采用X射线能谱仪检测细胞中钠、镁、钙等元素的百分含量，以钠长石（Albite）、氧化镁（MgO）及硅灰石（Wollastonite）作为标准品，所有经过分析的元素均经过归一化处理. 每个样品扫描3~ 6个区域，每个区域扫描3副以上谱图，计算各扫描区域不同元素百分含量的平均值.

    统计学处理：数据以x±s表示，采用Prism统计分析软件进行方差分析. P<0.05为差异具有统计学意义.

    2结果

    2.1HMGE对细胞增殖能力的影响经台盼兰染色，对照组和0，1,2 g环境处理组MG?63及MC3T3细胞拒染率均达90%以上. 与接种时的细胞数目（5×108/L）相比，MC3T3细胞在0，1，2 g及对照环境中培养24 h后，细胞平均增殖倍数分别为：-（0.21±0.06），0.91±0.17，0.49±0.04和1.08±0.18，且0，2 g环境处理组与对照组之间差异具有统计学意义(P<0.05)；而MG?63细胞在0，1，2 g及对照环境中培养24 h后，细胞平均增殖倍数分别为1.03±0.16，0.75±0.06，0.67±0.15，0.44±0.07，0 g环境处理组与对照组之间差异具有统计学意义(P<0.05).

    2.2HMGE对细胞形态的影响

    2.2.1MC3T3细胞形态学变化扫描电镜观察结果显示，0 g环境处理组MC3T3细胞变得扁平、立体感消失，细胞边缘卷起，呈三角形或多角形；1 g环境处理组MC3T3细胞呈四角形或多角形，细胞相对0 g环境处理组饱满；2 g环境处理组MC3T3细胞主要呈三角形或长梭形，细胞比较饱满，细胞表面有少量分泌的骨基质；对照组细胞状态好，长梭形或多角形、棒状，比较饱满，细胞表面有大量的骨基质，细胞之间的连接比较明显（图1）.

    2.2.2MG?63 细胞形态学变化电子显微镜下可见MG?63细胞形态变化与MC3T3细胞相似，0 g环境处理组MG?63细胞变得扁平，立体感消失；1 g环境处理组MG?63细胞扁平但形态多样，呈多角形，贴壁良好，核特别清楚；2 g环境处理组MG?63细胞核比较清楚，细胞呈多角形；对照组细胞形态不规则，状态良好（图2）.

    2.3HMGE对细胞中主要元素含量影响

    2.3.1MC3T3细胞中钙、钠、镁元素百分含量变化通过X射线能谱仪软件分析，HMGE对MC3T3细胞中主要元素百分含量的影响结果如表1所示. 0 g环境处理组MC3T3细胞与对照组相比较，钙元素百分含量略有上升，而钠元素含量略有下降，但差异无统计学意义（P>0.05）. 各组MC3T3细胞中镁元素百分含量变化不明显（P>0.05）. 表1HMGE对MC3T3细胞中钙、钠、镁等元素百分含量的影响

    2.3.2MG?63细胞中钙、钠、镁元素百分含量变化0，1，2 g环境处理组及对照组MG?63细胞中钙、镁、钠元素百分含量如表2所示. 与对照组相比，0 g环境处理组MG?63细胞中钙元素含量明显增加（P<0.01），但1，2 g环境处理组中钙元素含量却明显下降（P<0.05）. 各组细胞中钠元素百分含量与对照组相比差异不明显. 与对照组相比，0，1 g环境处理组MG?63细胞中镁元素百分含量明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05）. 表2HMGE对MG?63细胞中钙、钠、镁元素百分含量的影响

    3讨论

    大梯度强磁场抗磁性物质悬浮失重模拟技术是一种新型失重环境模拟技术，在生命研究中已有很多应用. 本研究利用大梯度强磁场产生的“强磁重力效应技术平台”，研究HMGE对成骨样细胞形态功能的影响，结果表明，HMGE影响了细胞的形态及增殖，但不同的细胞对该环境反应不同，这一结果提示了细胞功能的多样性，即不同种属细胞对某种刺激反应不同. 有研究［3-4］报道，磁悬浮模拟失重环境可以影响酵母细胞的增殖、周期及基因表达. 但与本研究不同的是酵母细胞属于原核细胞，其内部结构比较简单、遗传信息量较少. Dai等［7-8］报道的真实空间飞行及回转器模拟微重力效应，影响了成骨细胞MC3T3?E1的形态、周期、增殖及骨架的变化，该报道与本研究结果一致. 本研究组前期研究［9-10］结果表明，大梯度强磁场模拟失重环境影响了成骨、周期、粘附及分泌等功能. 这些结果提示，大梯度强磁场某种程度上可以模拟空间失重环境.

    本研究还发现，HMGE影响了成骨细胞中钙、镁、钠等元素百分含量，尤其是0 g环境可诱导成骨细胞中钙元素百分含量增加. 钙离子作为细胞内重要信号分子，参与细胞各种生命活动过程. Skok等［11］采用模拟失重处理SP?2/0和D6杂交瘤细胞，结果发现细胞内钙离子浓度增加，细胞生长受到抑制. 研究报道短期或长期空间飞行引起航天员生化和物理化学参数变化，包括水、渗透压、钠、钾、钙、镁等浓度变化，导致电介质调节紊乱［12］. 因此，我们推测强磁失重环境可能影响了细胞内的钙信号及细胞代谢.

    综上所述，HMGE影响了成骨细胞的增殖及其过程中主要元素的含量，其可能的作用机制是：细胞培养液中的荷电离子, 如钾、钠、氯、钙、镁、磷等离子，在HMGE的作用下，其荷电能力发生改变, 影响了这些离子的移动速度和排列形式, 使细胞代谢所需酶的活性或功能受到干扰, 细胞代谢水平降低, 最终使细胞的增殖能力降低.

    致谢感谢第四军医大学电镜教研室王春梅教授帮助分析扫描电镜及能谱实验结果.

【】
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［3］ Coleman CB, Gonzalez?Villalobos RA, Allen PL, et al. Diamagnetic levitation changes growth, cell cycle, and gene expression of Saccharomyces cerevisiae［J］. Biotechnol Bioeng, 2007,98(4): 854-863.

［4］ Coleman CB, Allen PL, Valles JM, et al. Transcriptional regulation of changes in growth, cell cycle, and gene expression of Saccharomyces cerevisiae due to changes in buoyancy［J］. Biotechnol Bioeng, 2008,100(2):334-343.

［5］ Glade N, Beaugnon E, Tabony J. Ground?based methods reproduce space?flight experiments and show that weak vibrations trigger microtubule self?organization［J］. Biophys Chem, 2006,121:1-6.

［6］ 商澎，尹大川，骞爱荣，等. 大梯度强磁场中进行空间重力生物学模拟实验的装置［P］. 专利：CN101188069(公开号).

［7］ Dai ZQ, Li YH, Ding B, et al. Effects of clinorotation on COL1A1?EGFP gene expression［J］. Sci China C Life Sci，2004，47(3): 203-210.

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