越桔原花青素对新生大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响
【关键词】 原花青素类;心肌；成纤维细胞;一氧化氮;一氧化氮合酶
0引言原花青素(procyanidin，PC)是越桔重要的生物活性成分，是表儿茶素和表没食子儿茶素的低聚体或多聚体. 有研究［1-3］发现，PC具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老及抗炎症等作用，但对越桔PC药理活性的相关研究还少见报道. 本研究以血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导心肌成纤维细胞(CFb)增殖，观察越桔PC对CFb诱导型一氧化氮合酶? 一氧化氮(iN0S?NO)系统的影响，以探讨PC抑制CFb增殖的初步机制.
1材料和方法
1.1材料Wistar大鼠30只，1～3日龄（吉林大学基础医学院实验动物中心）；越桔原花青素（南京苏朗医药科技开发有限公司）; AngⅡ和MTT（美国Sigma公司）；IMDM，血清（GIBCO公司）；iNOS一抗（Santa cruz公司）;胰蛋白酶（宝泰克生物科技公司）;羟脯氨酸试剂盒，iNOS试剂盒（南京建成生物工程公司）;TGF?β1 ELISA试剂盒（晶美生物工程有限公司）；NO试剂盒（碧云天生物技术研究所）；SP试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）；FITC羊抗兔Ig（北京中杉金桥生物技术有限公司）.
1.2方法
1.2.1细胞分离与培养Wistar大鼠无菌开胸取心肌, D?Hank?s液清洗,剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎片，20 mL/L胰蛋白酶反复消化(37℃水浴,8 min/次),分别收集各次消化上清液，1000 r/min,离心5 min，弃上清,用含10 mL/L血清的IMDM培养基重悬沉淀制成细胞悬液,接种培养瓶中,置37℃，50 mL/L CO2培养箱内培养. 用差速贴壁法去除内皮细胞及心肌细胞. 实验采用第3～5代细胞.
1.2.2实验分组与处理CFb细胞分为： 对照组，模型组，PC药物组. 各组细胞无血清培育24 h后，除对照组外均给予终浓度为1×10-7mol/L的AngⅡ，药物治疗组同时给予PC，终浓度分别为25，50，100 mg/L，对照组给予10 mL/L血清的IMDM培养基.
1.2.3MTT法检测将CFb以1×108/L个细胞密度接种于96孔板,每孔200 μL. 分别给予不同的处理因素作用48 h. 每孔加入MTT溶液（5 g/L） 20 μL，37℃继续培养4 h，终止培养，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min后，酶标仪490 nm波长处，测吸光度(A)值，以（各实验组A值/对照组A值）×100%表示细胞增殖率.
1.2.4TGF?β1蛋白及胶原含量测定各因素处理后，分别在培养的24和48 h吸取细胞上清液，按照试剂盒操作说明测定TGF?β1蛋白含量及胶原含量.
1.2.5NO含量、iNOS活性测定各处理因素与CFb共孵育6 h. 检测细胞上清夜中NO含量及iNOS活性的变化. 实验操作按NO,iNOS试剂盒说明书进行.
1.2.6免疫荧光细胞化学染色将CFb加入到预先放置盖玻片的24孔板，各因素作用6 h. 将生长有CFb的盖玻片取出，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min,山羊血清室温封闭30 min；滴加一抗（兔抗大鼠,1∶50稀释）4℃过夜;PBS洗3次;再滴加FITC标记的二抗(羊抗兔),37℃ 1 h, PBS洗15 min×3次;观察并拍照. 用Image?Pro Plus图像分析软件（Media Cybernetics公司）检测平均吸光度值.
统计学处理：实验数据以x±s表示，组间比较采用方差分析及q检验进行. P<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1PC对CFb增殖、胶原代谢及TGF?β1的影响与对照组相比较，AngⅡ模型组细胞增殖率、羟脯氨酸含量、TGF?β1含量均有增加（P<0.01）. PC在25，50，100 mg/L剂量时可抑制细胞增殖；降低羟脯氨酸及TGF?β1含量；与AngⅡ模型组相比较差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01，表1）.
2.2PC对iNOS蛋白表达、活性及NO含量的影响对照组CFb具有iNOS蛋白表达及活性,能够合成NO. AngⅡ模型组CFb iNOS蛋白表达减少、活性降低,NO的含量减少，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01). 各PC药物组均可增强CFb的蛋白表达及活性，提高NO含量，与AngⅡ模型组比较差异具有统计学意义（P<0.05，表1）.表1原花青素对CFb增殖、胶原代谢、TGF?β1及iN0S?NO系统的影响
3讨论心肌纤维化是以心脏间质CFb过度增殖和胶原过度沉积为特征的心脏间质重构. 研究［2-3］表明，AngⅡ可通过刺激CFb分泌TGF?β1而促进胶原生成. 本研究以AngⅡ作用于CFb构建心肌纤维化的细胞模型，实验结果显示：PC可降低AngⅡ诱导的CFb A值增高，TGF?β1增加，羟脯氨酸含量增多，表明PC可抑制心肌纤维化的发生.
NO是调节心肌纤维化的重要活性物质，它的生物合成受NOS调节. 体内NOS分为结构型NOS（cNOS）和诱导型NOS(iNOS). 免疫组化研究［4］发现，成纤维细胞中只有iNOS，即CFb具有内源性iNOS?NO系统. CFb合成的NO通过与铁?硫基团中铁发生配位结合,抑制非血红素铁?硫酶,干扰能量代谢和DNA合成；也可激活鸟苷酸环化酶从而抑制Ca2+内流, 最终抑制细胞增殖和胶原合成［5］. PC是越桔中的主要成分，也是其重要的生物活性物质. PC干预下的CFb，iNOS?NO系统活性的变化，以及与心肌纤维化的关系，尚少见报道. 本实验结果显示： AngⅡ与CFb共孵育6 h,即可见到NO及iNOS的变化，说明在CFb增殖的过程中，NO作为一种早期反应信号参与其中. 与AngⅡ模型组比较,PC（25～100 mg/L）可剂量依赖性地升高细胞培养液中NO含量，增加iNOS蛋白表达及其活性，表明 PC对CFb的iNOS?NO系统的活性具有促进作用. 此作用可表现在iNOS蛋白表达、iNOS活性、NO含量多个层次，即PC上调CFb的iNOS?NO系统的活性，可能是其抑制CFb增殖的作用机制之一. 有关iNOS蛋白活性的增高是由其蛋白绝对量增高直接引起，或是蛋白受修饰后间接引起还有待进一步研究.
【文献】
［1］ Al?Makdessi S, Sweidan H, Jacob R. Effect of oligomer procyanidins on reperfusion arrhythmias and lactate dehydrogenase release in the isolated rat heart［J］. Arzneimittelforschung，2006，56(5):317-321.
［2］ Basso N, Cini R, Pietrelli A, et al. Protective effect of long?term angiotensinⅡ inhibition［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293(3):1351-1358.
［3］ Chen K, Mehta JL, LI D, et al. Transforming growth factor beta receptor endoglin is expressed in cardiac fibroblasts and modulates profibrogenic actions of angiotensin Ⅱ［J］. Circ Res, 2004, 95(12):1167-1173.
［4］ Wright JW, Mizutani S, Harding JW. Pathways involved in the transition from hypertension to hypertrophy to heart failure. Treatment strategies. ［J］. Heart Fail Rev, 2008,13（3）：367-375.
［5］ Souza HC, Penteado DM, Martin?Pinge MC, et al. Nitric oxide synthesis blockade increases hypertrophy and cardiac fibrosis in rats submitted to aerobic training［J］. Arq Bras Cardiol, 2007,89(2):88-93,99-104.
