叶绿素铜钠盐联合环孢菌素A对免疫介导再生障碍性贫血模型小鼠的实验研究

                        作者：巨君芳 周平 张如富 魏克民

【摘要】  　　目的 探讨叶绿素铜钠盐(SCC)联合环孢菌素A(CsA)再生障碍性贫血(AA)的疗效。 方法 建立免疫介导AA模型小鼠，分别胃饲2种不同剂量SCC 12.5mg/(kg·d)+CsA 12.5mg/(kg·d), SCC 25mg/(kg·d)+CsA 12.5mg/(kg·d),以CsA，SCC［各25mg/(kg·d）］为阳性对照组,正常对照组及模型对照组胃饲生理盐水,每组灌胃0.5ml/d，分2次给药，连续14d，分别检测血象，另取股骨作骨髓病理切片。结果 SCC+CsA小剂量组WBC、HB、PLT均明显高于AA模型组，且HB，PLT分别高于SCC组和CsA组（P＜0.05）。骨髓病理切片显示SCC+CsA小剂量组骨髓增生较模型组小鼠(造血组织容量＜34%）改善明显(造血组织容量80%)。 结论 SCC+CsA促进AA模型小鼠造血功能，提高小鼠外周血白细胞、血红蛋白、血小板三系，对AA模型小鼠具有一定的治疗作用，且疗效好于单用SCC、CsA。

【关键词】  再生障碍性贫血 叶绿素铜钠盐 环孢菌素A 实验研究

　　【Abstract】  Objective  To explore the therapeutic effect of Sodium Copper Chlorophyllin combined with Cyclosporin A in treating AA (Aplastic Anemia, AA) model mice . Methods  To establish immune-mediated AA model, BALB/c rats(equal number of male and female )were randomly divided into six groups: the normal group, the AA model group, the CsA group ,the SCC group, the combination of SCC and CSA group, the combination of SCC and CSA low-dose group. They were given distilled water, CsA and SCC ［Each 25 mg / (kg·d]］, SCC 12.5mg / (kg·d) + CsA 12.5mg / (kg·d), the SCC 25mg / (kg·d) + CsA 12.5mg / (kg·d) , 0.5 ml twice daily for 14 days respectively , then hemogram were tested and pathological section of femur bone marrow were observed by biopsy. Results  The number of WBC、HB、PLT of the AA model mice in the combination of  SCC and CsA low-does group was significantly higher than in the AA model group,the CsA group and the SCC group（P＜0.05), showing the combination of SCC and CsA low-dose group for WBC,HB,PLT  recovery was better than the single-used SCC and the CsA. Bone marrow biopsy showed bone marrow hyperplasia cf the SCC Combined With CSA low-dose group compared to the AA model rats (hematopoietic tissue capacity less than 34%) improved significantly (hematopoietic tissue capacity 80%). Conclusion  Sodium Copper Chlorophyllin combined with Cychosporin A has obviose effects on recovering the hematopoiesis of the AA model rats, promoting white blood cell, hemoglobin, platelet three lines. The combination of SCC and CsA low-dose group in particular haS better effect than single use of SCC and CSA.

　　【key words】  Aplastic Anemia  Sodium Copper Chlorphll  CyclosporinA  Efficacy experiment    　　

　　再生障碍性贫血（AA）简称再障，是由于获得性骨髓功能衰竭，造成全血细胞减少的一种疾病。作者自2006年9月至2007年12月用叶绿素铜钠盐联合环孢菌素A(CsA)对AA模型小鼠进行实验研究，旨在探讨两者合用可起到协同增效作用，从而明显提高治疗再障的疗效。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物 

　　BALB/c小鼠，8～12周龄，体重16～20g,雌雄不限，作为受体，DBA/2小鼠，8～10周龄，体重16～20g, 雌雄不限，作为供体,由院上海实验动物中心提供。

　　1.2 实验药品及配制 

　　新山地明胶囊(环孢菌素A)（10mg/粒  Novartis Pharma Gmbh  Germany生产 进口药品注册证号：H20050271 批号S0001）灌胃前用生理盐水将其配成1mg/ml溶液。SCC由浙江省中医药研究院提供,用生理盐水配制成 3mg/ml、6mg/ml。

　　1.3 造模方法 

　　根据姚氏［1］方法，取DBA/2小鼠，断头处死，75%酒精浸泡消毒5 min后，无菌取出胸腺、腋下、腹股沟等处的淋巴结，加RPMI-1640培养基，除去表面血污及粘附的结缔组织，再次清洗后，用手术刀、剪刀反复剪切组织，直到成糊状，再轻轻研磨，用200钢目网过滤，使之成为单细胞悬液,计数后配成5×106/ml浓度，其胸腺细胞：淋巴细胞为1：2。取1滴苔盼蓝滴入玻片上鉴定细胞活性应＞95%。在浙大农学院动物辐照中心，BALB/c小鼠经60coγ射线5.5Gy(1.1 Gy/min×5 min)作一次全身照射，亚致死剂量照射后2 h内，立即尾静脉输入上述细胞悬液，每只小鼠输入0.2ml，制成AA动物模型。

　　1.4  实验分组 

　　将BALB/c小鼠随机分为6组，每组10只，即叶绿素铜钠盐组（SCC组 A组），环孢菌素A组（CsA组 B组），叶绿素铜钠盐与环孢菌素A组［（SCC+ CsA组1） C组］，叶绿素铜钠盐与环孢菌素A组小剂量组［（SCC+ CsA组2）D组］ ，模型对照组(E组)，正常对照组(F组)。

　　1.5  给药方法 

　　每组灌胃0.5ml/d，分2次给药，连续14d。A组每只小鼠每天给予SCC 0.25 ml/10g的SCC溶液（相当与成人剂量的12.5倍），B组每只小鼠每天给予0.25 ml/10g的SCC溶液（相当与成人剂量的5倍），C组1每只小鼠每天分别给予6mg/ml的SCC溶液0.25 ml/10g、1mg/ml的CsA溶液0.25 ml/10g。D组2每只小鼠每天分别给予3mg/ml的SCC溶液0.25 ml/10g、1mg/ml的CsA溶液0.25 ml/10g，F组和E组每只小鼠每天给予0.25 ml/10g的生理盐水。

　　1.6  指标检测 

　　观察满14d的小鼠，摘取右侧眼球，取血，EDTA抗凝，用法国HYLEL血细胞分析仪检测血常规。各组的BALB/c小鼠脱臼处死，取股骨，Bouin’s液固定，然后脱钙，常规石蜡切片，HE染色。

　　1.7  统计学处理 

　　数据以(x±s)表示，组间比较采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  SCC+CsA对AA模型小鼠外周血血象的影响

　　各组间的比较  见表1。(1)对白细胞的影响：与F组比较，A组白细胞下降明显（P＜0.05），E组与D组白细胞组下降非常明显（P＜0.01）；与E组比较，C组及B组白细胞升高明显（P＜0.05）；C、D组白细胞与A、B组比较，无显著性差异（P＞0.05）。(2)对血红蛋白的影响：与F组比较，A组与D组血红蛋白下降明显（P＜0.05），其余各组血红蛋白下降非常明显（P＜0.01）；与E组比较，C组与A组血红蛋白升高明显（P＜0.05），D组血红蛋白升高非常明显（P＜0.01）；D组血红蛋白与A组、B组比较升高明显（P＜0.05）。（３）对血小板的影响：与F组比较，A组与D组血小板明显下降（P＜0.05），E组、B组与C下降非常明显（P＜0.01）；与E组比较，各组血小板明显上升（P＜0.05）；D组与B组比较，血小板明显上升（P＜0.05）。由此可见，叶绿素铜钠盐联合环孢菌素A对AA模型小鼠血三系的恢复有效，其中D组效果最明显，且疗效好于A、B组。表1  AA模型小鼠各组外周血血象的比较（略）

　　2.2  叶绿素铜钠盐联合环孢菌素A对 AA模型小鼠骨髓病理的影响 

　　观察满14d的小鼠骨髓病理变化见图1，发现E组小鼠增生极度低下(造血组织容量<34%），造血细胞减少，脂肪细胞增多，间质水肿，血窦扩张，无巨核细胞等改变。用药各组骨髓增生仍低下，但较E组有不同程度的改善, D组骨髓增生改善明显 (造血组织容量80%）。F组小鼠骨髓增生明显活跃(造血组织容量95%）。

　　3  讨论
    　　
　　再障的病因很复杂,但目前认为免疫介导的造血抑制是AA 的主要发病机制［2］。 CsA 作为一种免疫抑制剂,治疗再障是通过免疫调节改变T淋巴细胞比例，从而去除骨髓造血的免疫抑制作用，使其恢复造血［3］。 叶绿素铜钠盐是从蚕砂中提取的糊状叶绿素经络合铜而成。林庚庭［4］实验研究表明，叶绿素铜钠盐能够有效降低造血负调控因子，调节造血因子的代谢，促进造血干/祖细胞的造血功能。叶绿素铜钠盐联合环孢菌素A是中西医结合治疗再障的一种新思路。杨云等［5］用叶绿素铜钠盐联合康力龙和CsA治疗慢性再障的临床研究表明，起效时间较前缩短，患者治疗1个月时，白细胞、血红蛋白、血小板、中性粒细胞及网织红细胞较前明显升高，并且造血功能恢复速度增快。
        
　　本研究发现，叶绿素铜钠盐联合环孢菌素A能促进AA模型小鼠造血功能，提高小鼠外周血白细胞、血红蛋白、血小板三系，其中叶绿素铜钠盐联合环孢菌素A小剂量组效果最明显，疗效好于单用叶绿素铜钠盐、环孢菌素A，证实叶绿素铜钠盐与环孢菌素A合用可产生协同增效作用，纠正异常的免疫功能，使增生的造血干/祖细胞免受抑制性T淋巴细胞阻碍骨髓造血的恢复,为临床治疗再障提供可靠的实验依据。

【】
  　　1 姚军．淋巴细胞与再生障碍性贫血关系的实验研究．中华血液学杂志，1991，12（5）：229.

　　2 Nakao S, Takamatsu H , Yachie A, et al. Establishment of a CD4+ T cells from a patient with immune mediated aplastic anemia. Exp hematol,1995,23:433～438.

　　3 Leonard EM, Raefsky E, Criffith P, et al. Cyclosporin therapy of aplastic aniemia,congenital and acquired red cell aplasia. Br J Haematol,1989,72:278～279.

　　4 林庚庭，魏克民，浦锦宝，等 叶绿素铜盐对AA模型小鼠的实验研究. 中医研究，2007，20（1）：14～16.

　　5 杨云，张王刚，曹星梅，等. 叶绿素铜钠片治疗慢性再生障碍性贫血的临床研究. 临床血液学杂志， 2005，18（9）：271～273.