乌司他丁对急性百草枯中毒大鼠肺病理改变的作用研究
作者：赵群远 陈安宝 梁道明 胡强 王刚 徐晓玲
【摘要】 目的 通过研究乌司他丁(utinastatin,UTI)对急性百草枯（paraquat，PQ）中毒大鼠肺病改变的作用研究，探讨乌司他丁对 PQ 中毒大鼠的肺损伤是否具有保护作用。方法 取SD 大鼠 72 只 ,随机均分为三组，中毒组、乌司他丁组和正常对照组。中毒组及乌司他丁组用百草枯 120 mg/ kg灌胃 ,一次性染毒；乌司他丁组从染毒后2h开始，腹腔内注射乌司他丁7.5万U/kg，1次/d，至处死前；中毒组及正常对照组用等体积无菌生理盐水腹腔内注射，1次/d，至处死前。分三个不同时间点（6、24、72h）处死大鼠（每组每个时间点8只），并取肺组织制备标本后分别在光镜及电镜下观察肺组织的病理学改变。结果 中毒组大鼠肺的病理学改变为急性弥漫性肺损伤，表现为肺泡腔内出血、渗出，炎性细胞浸润、肺泡隔炎性细胞浸润及纤维组织增生，Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞坏死脱落；乌司他丁组大鼠的病理学改变为局灶性肺泡隔少量炎性细胞浸润，而Ⅰ型上皮细胞完整，Ⅱ型上皮细胞也无明显损伤，未见纤维组织增生。结论 从病理学角度观察，乌司他丁对百草枯中毒大鼠的肺损伤具有保护作用。
【关键词】 乌司他丁 百草枯 中毒 病理 肺损伤
【Abstract】Objective To study the effect of ulinastatin on lung pathological changes in paraquat intoxication rats and investigate whether ulinastatin has protective effect on lung injury of rats with paraquat intoxication . Methods 72 sprague-dawley(SD) rats were randomly divided into 3 groups: intoxication group, ulinastatin group and control group.120 mg/ kg paraquat dissolvent was poured into stomach of rats by intragastric administration in intoxication group and ulinastatin group for once .After 2 hours, 75000UI/kg ulinastatin was injected by peritoneal injection in ulinastatin group ,once a day until scarificated, equal volume normal sodium was injected by peritoneal injection in the other two groups, once a day until sacrificed. Then sacrificing the rats in 3 groups at 3 time points (6h,24h,72h), collecting the lung tissue and observed them by light microscope and electron microscope results inflammatory cells and increased fiber in alveolar septum, type I alveolar cell and type II alveolar cell were necrosis. Compared with intoxication group ,there were no significant pathological changes in ulinastatin group except for inflammatory cells in alveolar septum. Conclusion Ulinastatin has protective effect on lung injury of rats with paraquat intoxication. 【Key words】 Paraqurt Intoxication Pathological change Lung injury Ulinastatin
百草枯(paraqust,PQ)系1,1- 二甲基- 4,4- 联吡啶二氯化物,于1962年作为除草剂上市后已在130多个国家广泛使用,由于其中毒死亡率高（大约50%～80%）而引起人们重视。PQ中毒机制目前尚未完全阐明,故对其还处于探索阶段。乌司他丁(utinastatin,UTI)是一种高效、广谱的酶抑制剂 ,能抑制多种蛋白酶 ,具有防御组织破坏、抑制炎症介质释放、稳定细胞膜和保护血管功能的作用。本实验从病理学角度，探讨乌司他丁对百草枯中毒大鼠的肺损伤是否具有保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料
健康成年SD大鼠72 只，均为雌性，购自昆明医学院动物科，标准喂养，体重200～250g。主要试剂为20%百草枯水剂（深圳瑞德丰农药有限公司生产）。乌司他丁注射液（广东天普生化医药股份有限公司），10万U/支。
1.2 方法
(1)动物分组及百草枯中毒模型建立:采用随机数字表法,将大鼠分为三组,每组24只,中毒组及乌司他丁组用百草枯 120 mg/ kg灌胃,一次性染毒，乌司他丁组再从染毒后2h开始，腹腔内注射乌司他丁7.5万U/kg，1次/d，至处死前；中毒组及正常对照组大鼠用等体积无菌生理盐水腹腔内注射，1次/d，至处死前。(2)标本采集与制备：大鼠分别于中毒后6、24、72h分批处死，每个时间点每组8只，摘取肺脏，用95%乙醇固定，包埋，切片，行常规苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察；按电镜常规制备标本，染色，电镜下观察。
2 结果
2.1 光镜观察（HE 染色）
中毒组大鼠（6、24、72h）见肺瘀血，表现为毛细血管扩张、充血，并可见肺泡腔内以中性粒细胞为主的炎性细胞的浸润，见图1；乌司他丁组大鼠（6、24、72h）可见局灶性肺泡隔内少量炎性细胞浸润。
2.2 电镜观察
中毒组大鼠 6h出现Ⅰ型肺泡上皮细胞肿胀，Ⅱ型肺泡上皮细胞内板层小体减少，并可见空泡（板层小体内容物排空），见图2；24h出现肺泡腔出血，Ⅰ型上皮细胞肿胀，Ⅱ型上皮细胞坏死，见图3；72h出现Ⅰ型、Ⅱ型上皮细胞坏死脱落，肺泡腔内出血,且有渗出液，并可见肺泡隔内增生的纤维组织，见图4。乌司他丁组大鼠6、24、72h均见Ⅰ型上皮细胞完整，Ⅱ型上皮细胞无明显损伤，肺泡腔内无出血、渗出，肺泡隔内纤维组织增生不明显，见图5。
3 讨论
PQ进入人体内后可引起多脏器受损，其中以肺受损最为严重，早期为急性弥漫性肺损伤，后期为肺纤维化，多数患者最终死于呼吸衰竭。目前的研究认为, PQ引起肺损伤的机制在于氧化还原循环反应产生的毒性物质对肺造成的损伤。PQ通过肺泡上皮细胞和支气管的CIara 细胞（无纤毛柱状分泌细胞）进入肺内，由还原型辅酶II (NADPH) 辅助的单还原为自由基，然后再与分子氧形成超氧阴离子自由基，经超氧化物歧化酶（SOD）形成过氧化氢，进一步形成毒性更高的羟自由基(OH-) ,OH-通过与生物分子如蛋白质或膜脂肪酸互相作用产生更多自由基, 破坏细胞功能, 导致细胞死亡［１］，同时炎症介质及细胞因子在PQ引起的肺损伤中起了重要作用。PQ 中毒后，肺部有大量炎性细胞浸润，包括肺泡巨噬细胞。肺泡巨噬细胞能合成和释放大量具有多种生物活性的细胞因子、前炎症介质、趋化因子及蛋白酶等, Gregory等［２］在给大鼠腹腔内注射PQ25mg/kg后 ,发现肺组织和支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α( TNF-α)、干扰素-γ ( IFN-γ) 、单核细胞炎症因22 (MIP22)均较对照组明显升高 ,这在中毒后第 1、2天最显著。转化生长因子-α（TGF-α）、血小板衍生生长因子（PDGF）、干扰素（IFN-γ）、血管紧张素-2(ang-2)也参与了肺的纤维化［３］。 Ruiz［４］ 的研究还认为胶原酶和金属蛋白酶的组织抑制物之间的不平衡,过度的凝胶分解活性和肺泡上皮凋亡，共同参与了肺纤维化的产生。本实验中PQ中毒大鼠的肺组织光镜下出现了以中性粒细胞为主的炎性细胞的浸润及毛细血管的扩张、充血，电镜下可见Ⅰ型上皮细胞的肿胀、坏死、脱落，Ⅱ型上皮细胞功能受损，表现为板层小体减少，形成空泡，最后坏死脱落，肺泡隔内可见增生的纤维组织。
本实验，乌司他丁组大鼠肺组织在光镜下未见毛细血管扩张、充血及弥漫性炎症反应，表明乌司他丁抑制了过度的炎症反应，保护了毛细血管内皮细胞，改善了肺部的微循环；电镜下未见Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞的坏死脱落，Ⅱ型上皮细胞板层小体无明显排空，无明显纤维组织增生，表明乌司他丁能稳定肺泡上皮细胞细胞膜和细胞器的生理功能，减少肺内自由基及炎症介质、细胞因子对Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞的损伤，维持了肺泡上皮细胞的功能，从而维持了肺泡的功能。本实验结果表明，乌司他丁对PQ 中毒大鼠肺损伤有保护作用。
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