FHIT和PCNA在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达与临床意义
【摘要】 目的 研究脆性组氨酸三联体基因（FHIT）蛋白和增殖细胞核抗原（PCNA）在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌中的表达情况，探讨两者在宫颈癌早期诊断和发生中的临床意义。方法 采用免疫组织化学SP法检测20例正常宫颈组织；20例宫颈CINⅠ级、25例CINⅡ/Ⅲ级；60例宫颈癌组织中的FHIT蛋白和PCNA的表达。结果 FHIT蛋白在正常宫颈组、宫颈CIN组、CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组和宫颈癌组中的阴性率分别为0%（0/20）、24.4%（11/45）、10.0%（2/20）、36.0%（9/25）和66.7%（40/60），各组间阴性率比较差异有统计学意义（P＜0.05）；PCNA在正常宫颈组织、宫颈CIN组、宫颈癌组中的阳性率分别是65.0%（13/20）、93.3%（42/45）和98.3%（59/60），各组间阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)；在宫颈CIN和宫颈癌中，FHIT和PCNA的表达有一定的相关性(P<0.05)。结论 检测宫颈CIN中的FHIT蛋白表达情况，可用作高级别的CIN筛查或预测。FHIT和PCNA对于宫颈癌前期病变和宫颈癌的筛查和早期诊断具有一定的临床价值。
【关键词】 宫颈上皮内瘤变 宫颈癌 组氨酸三联体 增殖细胞核抗原 免疫组织化学 早期诊断
【Abstract】 Objective To study the expression of fragile histidine triad (FHIT) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in normal cervix, cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and cervical cancer. To discuss the potential involvement of FHIT and PCNA in tumorigenesis，metastasis in cervical cancer; to discuss the significance of FHIT and PCNA in early diagnosis of cervical cancer. Methods The expressions of FHIT protein and PCNA were detected by immunohistochemistry in 20 cases of normal cervix, 20 cases of CINⅠ,25 cases of CINⅡ/Ⅲ, 60 cases of cervical cancer. Results The percentages of negative expression of FHIT protein in normal tissues were 0%(0/20), 24.4%（11/45）in CIN group,10.0%（2/20） in CINⅠgroup,36.0%（9/25）in CINⅡ/Ⅲ group and 66.7%（40/60）in cervical cancer group. There were significant differences between groups (Chi-square test, P<0.05). The positive expression rate of PCNA wase 65.0% （13/20）in normal group, 93.3% （42/45）in CIN group, and 98.3%（59/60）in cervical cancer group. There was significant difference between groups (Chi-square test, P<0.05). FHIT protein expression and PCNA expression were negatively related (P<0.05) in CIN and cervical cancer. Conclusion Since the expression level of FHIT is associated with the grade of CIN, it can be used to screen or forecasting higher-grade- group of CIN. FHIT and PCNA has clinical reference value for screening and early diagnosis of cervical lesions and cervical cancer.
【Key words】 Cervical intraepithelial neoplasia (CIN) Cervical carcinoma Fragile histidine triad (FHIT) Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) Immunohistochemistry Early diagnosis 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，在全球妇女恶性肿瘤中居第2位，占所有妇科恶性肿瘤的10%～12%［1］。脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad,FHIT）是一候选抑癌基因，许多研究报道多种肿瘤细胞系和原发性肿瘤中均发现有FHIT基因的异常转录和表达，包括宫颈癌。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）又称周期抗原，其含量反映了细胞的增殖程度，可作为人类肿瘤和预后的指标［2］。本研究应用免疫组化技术检测FHIT和PCNA在正常宫颈、CIN和宫颈癌组织中的表达情况，探讨其临床意义。
1 对象与方法
1.1 研究对象 收集2007年1月至2008年12月，温州医学院附属第一病理科保存的石蜡包埋组织标本，共125例。其中正常宫颈组织20例，宫颈CINⅠ级20例，CINⅡ/Ⅲ级25例，宫颈癌60例。正常组20例为因子宫良性病变而行子宫全切的正常宫颈组织标本。CIN组45例均为门诊宫颈活检标本。宫颈癌标本均为宫颈癌住院患者手术后标本，术前均未接受放、化疗及其他辅助。
1.2 方法 全部标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片2张。采用免疫组化SP法检测，根据说明书进行常规操作。高压锅喷气进行抗原修复。兔抗人FHIT多克隆抗体、鼠抗人PCNA单克隆抗体均为美国NeoMarkers公司产品，购自福州迈新生物技术开发有限公司。FHIT一抗稀释度1∶50，PCNA一抗为即用型。FHIT和PCNA的阳性及阴性对照片均由迈新公司随试剂提供。
1.3 结果判断 染色结果判定由两位经验丰富的妇科病理医生盲法独立阅片完成，核对结果，取得共识。FHIT表达结果判定：FHIT蛋白以胞浆和/或胞核内出现棕黄色颗粒视为阳性细胞。在400倍显微镜下选10个视野，共计数1000个细胞。FHIT表达的判断标准［3］：（1）根据染色强度：不染色或弱染色（浅黄色）为1分；中度染色（棕黄色）为2分；强染色（棕褐色）为3分。（2）根据染色范围：阳性细胞百分比＜10%为1分，10%～50%为2分，＞50%为3分。将上述两种得分相乘，≤3分为FHIT表达缺失，记为阴性（-），＞3分为表达正常，记为阳性（+）。PCNA表达结果判定［4］：细胞核出现棕黄色颗粒为PCNA阳性。在400倍显微镜下选10个视野，共计数1000个细胞，统计阳性细胞的百分数，＜10%记为阴性（-），≥10%记为阳性（+）。
1.4 统计学处理 所有数据输入EXCEL进行整理，统计处理均用SPSS for windows 11.5统计软件进行。免疫组化的阳性表达率为计数资料，采用四格表或列联表χ2检验。设定P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 不同病变宫颈组织中FHIT的表达 在正常宫颈组织中FHIT阴性率为0。CIN组、CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组和宫颈癌组中FHIT的阴性率分别为24.4%（11/45）、10.0%（2/20）、36.0%（9/25）和66.7%（40/60）。运用列联表χ2检验，对各组间阴性率进行比较，差异有统计学意义(P<0.05)。正常组与CIN组、与宫颈癌组比较，CINⅠ组与CINⅡ/Ⅲ组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。免疫组化检测结果见图1、2、3。 表1 不同病变宫颈组织中FHIT的表达 注：*与正常组比较，P＜0.05；△与CIN组比较，P＜0.05；☆与CINⅠ比较，P＜0.05
2.2 不同宫颈组织中PCNA的表达 在正常宫颈组织、宫颈CIN组、宫颈癌组中PCNA的阳性率分别是65.0%（13/20）、93.3%（42/45）和98.3%（59/60），运用列联表χ2检验，对各组间阳性率进行比较，差异有统计学意义(P<0.05)。正常组与CIN组、与宫颈癌组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。免疫组化检测结果见图4、5、6。表2 不同宫颈组织中PCNA的表达注：*与正常组比较，P＜0.05
2.3 FHIT与PCNA表达之间的关系 在宫颈CIN和宫颈癌中，FHIT表达阴性而PCNA表达阳性的患者为51例，FHIT表达阳性而PCNA表达阴性的患者为4例。两个指标的表达同时为阳性的患者为50例，而两个指标的表达同时为阴性的患者为0例。应用配对四格表χ2检验，差异有统计学意义（表3）。表3 宫颈CIN和宫颈癌中FHIT与PCNA表达之间的关系
3 讨论
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。宫颈癌有较长的癌前病变阶段，约为10年。早期检查，尽早发现癌前病变是预防宫颈癌的最有效手段，从这个意义上来说，宫颈癌是可防可治的［5］。脆性组氨酸三联体基因（FHIT）是在染色体3p区域发现的候选抑癌基因，已有研究发现该基因与多种肿瘤的发生发展有关［6］。增殖细胞核抗原（PCNA）是细胞增殖所必需的蛋白，肿瘤形成时表达增高，常被用于反映肿瘤细胞的增殖状态。因此，作者研究FHIT蛋白和PCNA在宫颈癌前期病变和宫颈癌中的表达情况，以探讨其临床意义。
3.1 FHIT与宫颈病变的关系 1996年，Ohta等［7］利用外显子捕获法，在3p14.2区域找到一个新的候选抑癌基因，该基因跨越人类染色体脆性部位FRA3B和家族性肾细胞癌基因相关的染色体交叉异位t（3;8）（p14.2;424）断裂点，并含有编码组氨酸三联体的功能区，遂被命名脆性组氨酸三联体（FHIT）。FHIT基因位于3p14.2，在染色体上占据500kb大小的位置，含10个外显子，转录1个长1100bp的mRNA并编码147个氨基酸16.8kD的蛋白质。外显子5至9组成开放性阅读框架（open reading frame,ORF）,编码FHIT蛋白质。FHIT蛋白在肿瘤中的作用尚不完全清楚，一般认为存在以下机制：（1）调控细胞周期［8］；（2）诱导细胞凋亡；（3）Ap3A水解酶活性；（4）FHIT底物复合物的作用；（5）Asish等［9］发现FHIT蛋白可与tubulin结合，后者为形成微管的主要成分，从而抑制细胞的分裂与增生；（6）mRNA脱帽功能；（7）FHIT基因失活还与DNA损伤后修复能力增加相关，提示FHIT基因依赖的DNA损伤修复反应可能在肿瘤进展中起一定作用［10］。本研究显示，FHIT在正常的宫颈组织中均为阳性表达，无缺失发生。在CIN组中的阴性率为24.4%，与正常组比较P＜0.05，差异有统计学意义。CINⅠ级和CINⅡ/Ⅲ级中FHIT的阴性率分别为10.0%和36.0%，两者比较差异有统计学意义，提示检测CIN中的FHIT蛋白，可用作高级别的CIN筛查。FHIT在宫颈癌组中的阴性率为66.7%，与正常组比较P＜0.05，差异有统计学意义。本研究还显示，在宫颈CIN三个期别的各组中，均有FHIT的阴性表达，说明FHIT表达缺失在宫颈病变的早期就已经开始，由此推测，FHIT表达缺失是宫颈癌发生的早期事件。而宫颈癌中FHIT的阴性率高达66.7%，说明FHIT表达缺失与宫颈癌有着密切的关系。这与Butler等［8］的报道一致。Nakagawa等［11］的研究也提出相同的结论，即FHIT基因的表达缺失在启动宫颈鳞癌的发生中起重要作用，而不是肿瘤进展的结果。
3.2 PCNA与宫颈病变的关系 PCNA是一种核内蛋白质，分子量为36kD，从人PCNA的cDNA序列推知人PCNA蛋白含有261个氨基酸，是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，参与调节DNA的合成，与细胞的增殖周期密切相关。PCNA有两种存在形式：一种是可溶性，存在于静止和增殖细胞中，另一种为不溶性，紧密结合于细胞核DNA的特定位点上，免疫荧光技术证实只有这种PCNA与DNA复制位点有关，证明在DNA复制中起作用的是不溶性PCNA。PCNA在DNA模板链和随从链的合成过程中均起重要作用［12、13］。PCNA为增殖期细胞特异性表达的核蛋白，是目前肿瘤增殖活动研究中可靠的增殖期标志物［14］。幸海等［15］研究发现，CIN和宫颈癌PCNA表达阳性率显著高于正常宫颈，P<0.01。本研究也提示PCNA在宫颈CIN和宫颈癌中的阳性率分别为93.3%和98.3%，两者与正常宫颈中65.0%的阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与Wang等［16］的研究结果相似。本文还发现，PCNA的阳性率在CINⅠ级、CINⅡ/Ⅲ级及宫颈癌中分别是90.0%、96.0%及98.3%，这表明随着宫颈病变的加重，细胞的增殖活性增高。故PCNA可成为反映CIN和宫颈癌细胞异常增殖的灵敏标志。
3.3 宫颈CIN和宫颈癌中FHIT基因表达与PCNA表达之间的关系 许多学者研究表明用酵母双杂交法筛选到与FHIT蛋白相互作用的蛋白，它的序列与人泛素结合酶9完全相同，已知酵母的泛素结合酶9与S期及M期细胞周期蛋白的降解有关，因此推测FHIT蛋白可能通过泛素结合酶来调控细胞周期。同时检测点异常可能导致受损伤的DNA顺利进入S期，而不能得以修复，从而促使细胞转化或增殖失控或凋亡受阻。因此提示FHIT蛋白可能具有对细胞增殖的负性调控作用。FHIT基因缺失或突变可能导致FHIT蛋白表达降低或丧失，从而导致细胞的恶性增殖。本研究结果表明，FHIT基因的蛋白表达与PCNA的表达具有相关性（P<0.05），两者呈负相关，FHIT表达缺失者PCNA表达高，细胞增殖能力较强。有研究表明［17］，在子宫内膜腺癌中FHIT蛋白及PCNA的表达亦呈负相关。总之，FHIT蛋白的功能与调控细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制细胞分裂增生有关，而PCNA是反映细胞增殖活性的标志物，其含量反映细胞的增殖程度，作者推测，在正常宫颈组织中，FHIT蛋白和PCNA共同参与调节细胞增殖，二者存在平衡关系。而CIN和宫颈癌中，存在FHIT蛋白和PCNA的失衡，导致这种失衡的具体机制还有待于进一步研究。
总之，肿瘤的发生、是一个多步骤的过程，是在致病因素作用同时，多种基因同时或先后协同作用的结果。本研究表明，FHIT和PCNA均参与了宫颈癌前病变和宫颈癌的发生、发展。因此，作者认为，FHIT和PCNA对于宫颈癌前病变和宫颈癌的筛查及早期诊断具有一定的临床应用价值。
【】
1 Volgareva G,Zavalishina L,Andreeva Y,et al. Protein p16 as a marker of dysplastic and neoplastic alterations in cervical epithelial cells. BMC Cancer,2004,4:58.
2 Salvesen HB, Iversen OE, Akslen LA. Prognostic significance of angiogenesis and Ki-67,p53,and p21 expression:a poplulation based endometrial carcinoma study. J Clia Oncol,1999,17:1382～1390.
3 Connoll YD C,Grccnspan DL,Wu R,et al. Loss of FHIT expression in invasive cervical carcinomas and intraepithelial lesions with invasive disease. Clin Cancer Res,2000,6(9):3505～3510.
4 陈少敏,张友忠,曲迅.Ki-67、PCNA及HPV在宫颈癌和宫颈上皮内瘤变的表达及意义.妇产科进展,2007,16(8):581～583.
5 钱德英.阴道镜在宫颈诊断中的应用.实用妇科与产科杂志,2003,19(3):137.
6 常志伟,王立东,王宁博,等.家族史阳性和阴性食管癌患者癌组织中FHIT和BRCA2及MLH1的表达变化.中华肿瘤防治杂志,2006,13(18):1371～1374.
7 Ohta M,Inoue H,Cotticelli MG,et al. The FHIT gene,spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associatedt(3;8) breakpoint,is abnormal in digestive tract cancers. Cell,1996,84(4):587.
8 Murphy GA,Halliday D,McLennan AG. The Fhit tumor suppressor protein regulates the intracellular concerntration of diadenosine triphophate but not diadenosine tetraphosphate. Cancer Res, 2000,60(9):2342～2344.
9 Asish R,Chaudhuri AR,Israr A,et al. The tumor suppressor protein Fhit. A novel intraction with tubulin. J Biol Chem,1999,274(34):24378～24382.
10 Hu B, Han SY,Wang X,et al. Involvement of the Fhit gene in the ionizing radiation-activated ATR/CHK1 pathway. J Cell Physiol,2005,202(2):518.
11 Nakagawa S,Yoshikawa H, Kimura M,et al. A Possible Involvement of Aberrant Expression of the FHIT Gene in the Carcinogenesis of Squamous Cell carcinoma of the Uterine Cervix. Br J Cancer,1999,79(3～4):589～594.
12 Takasaki Y,Kaneda K,Takeuchi K,et al. Analysis of the structure of proteasome roliferating cell nuclear antigen (PCNA) multiprotein complex and its autoimmune response in lupus patients. Ann N Y Acad Sci,2003,987:316～318.
13 Sporbert A,Domaing P,Leonhardt H,et al. PCNA acts as a stationary loading platform for transiently interacting okazaki fragment maturation proteins. Oxford University Press,2005,33(11):3521～3528.
14 钱金芳.增殖细胞核抗原在常见肿瘤的研究进展.肿瘤基础与临床,2008,21(1):86～89.
15 幸海,耿明,陈诵芬,等.宫颈癌及其癌前病变组织中p16INK4a和PCNA的表达及临床意义.临床基础研究,2007,14(20):1563～1567.
16 Wang JL, Zheng BY, Li XD, et al. Predictive significance of the alterations of p16INK4A,P14ARF,p53 and proliferating cell nuclear antigen expression in the progression of cervical cancer. Clin Cancer Res,2004,10(7):2407～2414.
17 佟盛春,张岩,王永来,等.FHIT蛋白和PCNA在子宫内膜癌中的表达及意义.山西医药杂志,2008,37(2):105～109.
