实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑CalpainⅠ表达及其临床意义

【摘要】  目的 通过观察动物模型脑的钙蛋白酶(Calpain)Ⅰ表达的变化，探讨急性播散性脑脊髓炎的发病机制。方法 ①利用雌性Wistar大鼠建立自身免疫性脑脊髓炎（EAE）动物模型；②通过免疫组化染色动态观察EAE大鼠不同时段各组鼠脑内CalpainⅠ的分布及表达的变化情况。结果 CalpainⅠ在发病后7 d达高峰，且染色反应增强，与正常对照组相比有统计学意义（P<0.05）。结论 EAE模型建立方法稳定、可靠，成功率高。CalpainⅠ在正常大鼠的中枢神经系统中广泛存在。EAE发病过程中，CalpainⅠ在鼠脑表达增高。

【关键词】  实验性自身免疫性脑脊髓炎；钙蛋白酶；中枢神经系统

    【Abstract】  Objective  To investigate the expression of CalpainⅠin different periods during experimental auto-immune encephalomyelitis(EAE) in Wistar rats' brain.Method  1.To establish EAE model using female Wistar rats;2.Using immunohistochemical staining method,dynamically observe the distribution and changes of expression in different periods in EAE rats' brain.Results  Calpain Ⅰ reached peak at 7 days after onset,and staining was increased,which was statistically significant compared with the normal control group (P<0.05).Conclusion  The method of establishing EAE model is stable,reliable,and with high success rate.CalpainⅠexists widely in the CNS of normal rats.The expression of CalpainⅠis increased during the pathogenesis of EAE in the rat brain.

    【Keyword】  Experimental auto-immune encephalomyelitis(EAE);Calpain;Central nervous system（CNS）

    急性播散性脑脊髓炎（acute disseminated encephalomyeliti，ADEM）是以中枢神经系统（centralnevous system，CNS）白质的急性炎症性脱髓鞘病变为特点的自身免疫性疾病，确切病因及发病机制迄今不明［1］。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）与人的ADEM临床、生化、免疫及病理等诸方面具有相同或相似的特征，目前已被国内外公认是研究ADEM的理想的动物模型［2］。

    2006-06～2008-02本科应用急性EAE模型动态观察EAE发病过程中不同时期的CalpainⅠ表达的变化，旨在探讨EAE发病的病理生理，为临床ADEM提供理论基础，为Calpain抑制剂的应用时机、治疗持续时间等提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  一般资料

　　1.1  材料

　　1.1.1  实验动物 

　　健康Wistar雌性大鼠100只，6～8周龄，体重150～200 g；雌性豚鼠10只，体重300～400 g，由医科大学实验动物中心提供。

　　1.1.2  主要试剂及药品 

　　①完全福氏佐剂（CFA）：购自Sigma公司；百日咳疫苗原液（BPV）：购自北京生物制品研究所。②兔抗大鼠CalpainⅠ多克隆抗体，购于Abcam公司；Sp试剂盒和DAB显色盒均购于福建迈新公司。③多聚赖氨酸溶液：Sigma公司进口分装。用时蒸馏水1∶10稀释。

　　1.2  方法
 
　　1.2.1  完全抗原制备(EAE模型的抗原制备) 

　　取10只豚鼠称重后，按脑脊髓重量1 g加生理盐水1 mL的比例，冰浴中匀浆，再将匀浆液与等体积的完全福氏佐剂（CFA）充分混合，以无菌注射器及反复抽打制成油包水乳剂，作为抗原，4 ℃保存，12 h内用完。

　　1.2.2  EAE模型制备 

　　取20只Wistar大鼠分别称重、标号，正常饲养，不给予任何处理。将另80只Wistar大鼠分别称重、标号，按10 %水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，无菌状态下以百日咳疫苗原液0.1 mL/只（含2×1010个菌体）左后足背注射，以完全福氏佐剂（CFA）与豚鼠脑脊髓匀浆（GPSCH）混合液0.4 mL/只四足垫注射。其中8只注射后7 d做脑组织标本取材，为免疫后7 d组。

　　1.2.3  EAE模型神经功能评分 

　　0级：不发病；1级：尾部张力降低或轻度步态笨拙，双后肢轻度拖动；2级：尾部无张力，或中度步态笨拙，双后肢中度无力，明显拖动或姿态维持缺乏；3级：双后肢重度无力，但尚能拖动，肢体无力；4级：双后肢或四肢肢体瘫痪和尿便失禁；5级：濒死状态。

　　1.2.4  实验动物分组及给药 

　　从正常对照组中取8只；免疫后7 d未发病组8只；72只中53只造模成功，选择功能评分2～4级的EAE大鼠32只，随机分4组：发病后3、7、14、21 d组。

　　1.2.5  脑组织标本采集、组织固定及石蜡切片  。

　　1.2.6  HE染色及脑内calpainⅠ免疫组化检测（Sp法）。

　　1.3  图像采集与统计学分析 

　　各组每个时间点取8只大鼠，连续冠状切片，在相近层面（包括纹状体、额顶叶皮质、海马、侧脑室SVZ和室管膜等脑区）选取5张切片，每张切片在上述部位均选取同倍（×400）的3个不同视野，采用图像分析系统每个视野的免疫阳性细胞数（CalpainⅠ细胞），所有数据以均数±标准差（ x±s）表示，数据统计采用spss12.0 for windows软件系统处理，采用单因素方差分析，α＝0.05为检验水准，P＜0.05差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  EAE模型制作鉴定

　　2.1.1  EAE动物模型的行为学表现

　　实验组大鼠免疫后第12 d出现首例发病，随后陆续发病，潜伏期为（14.21±2.126）d，发病前大鼠出现体重突然下降、皮毛不光滑、食欲不振等表现，发病多以双后肢步态笨拙、活动不灵活为首发症状，后逐渐加重，出现双后肢瘫痪。发病后3～5 d临床症状达高峰并持续2 d左右，随后症状逐渐缓解。实验组患病率为73.6 ％（53/72）。对照组体重增加正常，观察到第28 d均未出现EAE临床表现。

　　2.1.2  HE染色结果 

　　光镜下可见EAE组大鼠脑和脊髓组织中有大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，血管内皮细胞增生、肿胀、破坏，胶质细胞增生，炎性细胞聚集在血管周围呈典型的“袖套”样改变；脑膜和脊膜也有炎性细胞浸润。对照组大鼠脑和脊髓均未见异常。

　　2.2  EAE时鼠脑的脑CalpainⅠ的变化 

　　CalpainI阳性细胞存在于胞浆中，染色成棕黄色。正常对照组大鼠脑组织中可见的CalpainI阳性细胞极少。在给予豚鼠脊髓匀浆免疫后CalpainI阳性细胞逐渐增多，在发病后7 d达高峰，且染色反应增强，然后逐渐下降，21 d仍高于正常，与正常对照组相比有统计学意义（P<0.05）；正常对照组CalpainI阳性细胞数与免疫后7 d、发病后3、7、14、21 d相比均有统计学意义（P<0.05）；发病后7 d组与其它各组相比均有统计学意义（P<0.05）。见表1。表1  各组鼠脑的脑CalpainI阳性细胞数比较（略）注：* P<0.05 与正常对照组相比  △ P<0.05 与EAE发病7 d组相比

　　3  讨论

    实验性EAE是由T淋巴细胞介导的，以中枢神经系统实质和血管周围单个核细胞（主要是T淋巴细胞和单核细胞）浸润以及白质脱髓鞘为特征的发生于敏感实验动物的自身免疫性疾病。EAE模型可采用主动或被动免疫诱导而成。本文参照刘颖等［3］的制备方法，采用EAE非敏感品系Wistar大鼠建立了EAE模型，发病动物临床表现与国内外报道相一致，模型制作的稳定性良好，患病率达到73.5 ％。本文采用常用的评分法对临床症状进行功能评分，同时进行病HE染色及髓鞘染色显示了血管周围典型的炎性细胞浸润和髓鞘脱失的特征性病理变化，符合EAE病理改变，本实验表明该动物模型建立方法可靠，成功率高。 

    Calpain是一组调节细胞功能的Ca2+依赖性半胱氨酸蛋白酶，广泛存在于绝大多数哺乳动物组织和细胞中，是个复杂的、高度调控的蛋白降解体系。Calpain系统具有多种生理功能，涉及许多方面。生理状态下Calpain小部分被激活，仅对目标底物产生有限的水解，其主要作用是维持细胞骨架的更新。而在病理状态下，细胞内持续的钙离子超载会使Calpain过度激活，并降解底物蛋白，引起病理损伤［4］。Calpain系由至少6种同工酶构成，根据其表达形式和组织分布特点可分为有或无组织特异性2大类［5，6］，目前已知存在于神经系统中的Calpain具有2种同工酶：Calpain Ⅰ (又称μ-Calpain)，Calpain Ⅱ ( 又称m-Calpain)。Calpain Ⅱ主要位于神经元体部和树突、轴突及胶质细胞，需要微摩尔钙浓度激活，Calpain Ⅰ位于胶质细胞，少量于轴突和髓磷脂，需要毫摩尔浓度激活。细胞内钙升高到一定程度，激活Calpain，引起神经元及轴突的形态改变和功能障碍。
   
　　大量的研究表明Calpain参与各种原因的中枢神经系统的损伤。Shields等［7，8］报道了有关Calpain在脱髓鞘病变中激活的证据，发现EAE脱髓鞘斑块内Calpain表达和活性增高，并且发现其目标蛋白质的裂解产物明显增高，故推测Calpain的过度激活可能为髓鞘缺失的直接因素之一。本实验免疫组化结果表明，Calpain广泛存在于正常大鼠CNS中，免疫后7 d就引起了CalpainⅠ大量表达，并且随着时间的延长逐渐加重。第7 d CalpainⅠ达高峰，然后逐渐下降，至21 d仍高于正常对照组，与正常对照组相比结果有显著性差异（P<0.05），说明Calpain在EAE中的高表达是一个早期、渐变、持续性的过程。

【】
  　　［1］Lutton J D,Winston R,Rodman T C. Multiple sclerosis:etiological mechanisms and future directions［J］. Exp Biol Med(Maywood),2004,229(1):12-20.

　　［2］彭津平，邱一华，程纯,等. 实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠的中枢和外周儿茶酚胺含量变化［J］. 应用生理学杂志，2000,16（3）：210-213.

　　［3］刘颖,刘华,辛晋敏，等. Wistar大鼠EAE模型的制备［J］. 长治医学院学报,2005,19(1):58-60.

　　［4］Schaecher KE,Shields DC,Banik NL. Mechanism of myelin breakdown in experimental demyelination:a putative role for calpain［J］. Neueochem Res,2001,26(6):731-737.

　　［5］Antella L,Kyozuka K,De Riso L,et al. Calcium,proteinase action,and the regulation of the cell cycle［J］. Cell Calcium,2000,23(2-3):123-130.

　　［6］Suzuki K. Nomenclature of calcium dependent proteinase［J］. Biomed Biochim Acta,1999,50:483-484.

　　［7］Shidlds DC,Banik NL. Upregulation of calpain activity and expression in experimental allergic encephalomyelitis:a putative role for calpain in demyelination［J］. Brain Res,1998,791(1-2):68-74.

　　［8］Shieds DC,Tyor WR,Deibler GE,et al. Increased calpain expression in experimental demyelinating optic neuritis:an immunocytochemical study［J］. Brain Res,1998 784(1-2):299-304.