锌和维生素E对糖尿病大鼠心肌COX?2表达的影响

【摘要】  目的：研究锌和维生素E对糖尿病大鼠心肌COX?2表达的影响,以此探讨锌和维生素E对糖尿病心肌细胞保护作用的机制。方法：按体重将大鼠随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只) ,各组大鼠禁食12h后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/ L、pH = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。一周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/L ,饮水量> 40ml/d ,尿糖强阳性( + + + ～ + + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。将选取糖尿病大鼠40只按血糖值体重分为:糖尿病对照组、糖尿病补锌组、糖尿病补VE组和糖尿病补Zn和VE组。6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学的实验,观察各组心肌组织中COX?2的表达水平, 利用HPIAS?2000图像分析系统测定COX?2在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。 结果：正常对照组心肌细胞内COX?2呈阴性表达, 糖尿病对照组心肌细胞内COX?2呈阳性表达；糖尿病补锌组和糖尿病补VE组心肌细胞内COX?2呈弱阳性表达；糖尿病补Zn+VE组心肌细胞内COX?2呈阴性表达。图像分析结果显示，糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间COX?2的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05)；糖尿病补Zn+VE组与正常组之间COX?2的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。 结论： Zn和VE联合使用可降低糖尿病大鼠心肌组织中COX?2的活性,对糖尿病大鼠心肌细胞起了重要的保护作用。

【关键词】  锌 维生素E 糖尿病 心肌

糖尿病( diabetes mellitus ,DM) 是一类由于胰岛素绝对或相对缺乏或胰岛素生物活性降低,或者以上两者共同引起之体内代谢失调及高血糖状态［1］。临床上主要分为2 型,即1 型糖尿病和2 型糖尿病,世界各国糖尿病患病率均上升,其中90 %为2 型糖尿病。
   
　　糖尿病性心肌病是糖尿病的慢性并发症之一,是糖尿病发病过程中特异性的心肌受损和心脏功能改变,糖尿病性心肌病的出现可以不伴有缺血性病变、血管病变及高血压等并发症。目前糖尿病性心肌病的确切病因还不清楚,但目前认为糖尿病性心肌病的发生主要与心肌能量代谢紊乱、Ca2+ 超载、血管动脉硬化、氧化应激、高血压及高血糖导致的心肌细胞凋亡等有关。糖尿病时,高血糖引起的氧化应激参与了心肌细胞的损伤。糖尿病在病理组织形态上主要是由于胰岛损伤,胰岛素绝对或相对缺乏所引起［2］ 。近年来,国内外许多学者经过临床和流行病学调查,以及周密设计的基础研究和实验研究,虽然对糖尿病的病因有了较多的认识,但对原发性糖尿病的病因仍然不清楚。因此对糖尿病的也就成了目前人们所关注的焦点。
   
　　环氧化酶又称为前列腺素内过氧化合成酶,前列腺素H合成酶,是催化花生四烯酸转变为前列腺素的限速酶。COX?2属于诱导型,静息时不表达,但可以在细胞因子、激素、致癌物质等多种诱导因子的刺激下快速表达,参与多种病理生理过程［3］。近年来研究表明,COX?2不仅与病理生理过程有关,与肿瘤的发生也有密切的联系。COX?2的高表达与糖尿病并发症的发生密切相关。
    
　　Zn 作为机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其水平的提高势必有利于这些酶活性的提高［4］。Zn 对细胞保护作用的途径之一,是基于控制过氧化作用［5］。VE 作为天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,促进机体正常发育,保护细胞膜稳定具有重要作用。锌和维生素E是抗氧化剂并具有细胞保护作用。本研究应用免疫组织化学方法观察了锌和维生素E联合应用对高血糖引起的心肌细胞内COX?2的表达,旨在探讨两者对糖尿病大鼠氧化应激时心肌结构的影响及对心肌细胞的保护作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

    实验动物为昆明种SD大鼠50只,雄性,体重180～200g,由武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1w后进行实验。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物模型建立及分组

    按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/ L、pH = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。一周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ L ,饮水量> 40 ml/ d ,尿糖强阳性( + + + ～ + + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。将选取糖尿病大鼠40只按血糖值参考体重分为糖尿病对照组、糖尿病补锌组、糖尿病补VE组和糖尿病补Zn+VE组。各组动物均喂饲人工合成饲料,配方:酪蛋白20 % ,玉米淀粉65% ,植物油8% ,纤维素1% ,混合维生素1% ,混合无机盐5%。混合维生素和无机盐配方参见［5］,合成饲料控制锌浓度为20mg/kg。正常对照组和实验组给予去离子水;补Zn 组给予Zn 浓度为20 mg/L的含ZnSO4·7H2O 去离子水;补VE 组每天以50 mg/ kgVE 灌胃;Zn和VE联合补充组在给予Zn浓度为20mg/L的含ZnSO4 ·7H2O 去离子水的同时以50mg/ kgVE灌胃。实验期间,密切观察动物进食和饮水量变化,每周称2次体重,6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验观察。

　　1.2.2  免疫组织化学S?P法检测COX?2相关抗原 

    主要步骤：

    ① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；

    ② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；

    ③ COX?2采用微波抗原修复（3档，10 min），PBS洗4×5min；

    ④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；

    ⑤ 一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min；

    ⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；

    ⑦ 链霉菌抗生物素蛋白?过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；

    ⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；

    ⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。

    用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.2.3  免疫组织化学结果判断 

    COX?2以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。

    采用HPIAS?2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对COX?2的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）。

　　1.2.4  统计学处理 

　　对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK?q检验，检验水准α为0.05。

　　2  结果

　　2.1  COX?2的表达

    正常对照组心肌细胞胞核内可见少量的棕黄色颗粒, COX?2   表达呈阴性, 糖尿病对照组心肌细胞胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒, COX?2表达呈阳性；糖尿病补锌组和糖尿病补VE组心肌细胞核内可见一些棕黄色颗粒, COX?2表达呈弱阳性；糖尿病补Zn+VE组心肌细胞核内可见少量的棕黄色颗粒, COX?2表达呈阴性。图像分析结果显示：正常对照组、糖尿病对照组、糖尿病补锌组、糖尿病补VE组、糖尿病补Zn+VE组平均光密度分别为0.0926±0.0214、0.2684±0.0527、0.1680±0.0254、0.1771±0.0280、0.0973±0.0524。正常对照组、糖尿病对照组、糖尿病补锌组、糖尿病补VE组、糖尿病补Zn+VE组COX?2的阳性面积率分别为0.0935±0.0162、0.2579±0.0397、0.1731±0.025、0.1643±0.019、0.1007±0.0208。糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间COX?2的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05)；糖尿病对照组与糖尿病补锌组、糖尿病补VE组之间COX?2的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。见表1。表1  糖尿病补Zn+VE组、糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组COX?2表达的平均
光密度和阳性面积率（略）注：*    正常对照组与糖尿病对照组比较， P＜0.05  ；**  糖尿病对照组与糖尿病补Zn+VE组比较，P＜0.05； #  正常对照组与糖尿病补锌组、糖尿病补VE组 及糖尿病补Zn+VE组比较，P＞0.05 。

　　3  讨论
   
　　糖尿病是一种常见的具有遗传倾向的葡萄糖代谢和内分泌障碍,是由于绝对性或相对性胰岛素分泌不足引起的。近半个世纪来,糖尿病患病率和死亡率有明显上升趋势,在我国已成为继心血管疾病、肿瘤之后列第三位的常见病、多发病和慢性非传染性疾病。糖尿病在病理组织形态上主要是由于胰岛损伤,胰岛素绝对或相对缺乏所引起［6］ 。近年来,国内外许多学者经过临床和流行病学调查,以及周密设计的基础研究和实验研究,虽然对糖尿病的病因有了较多的认识,但对原发性糖尿病的病因仍然不清楚。较一致的看法认为与遗传、环境、病毒感染、肥胖、种族、营养物质代谢和内分泌失调等因素有关。引起生物体自由基生成增多的原因与诱发糖尿病的因素存在着交叉性。当自由基在体内的产生增加时,由于其特殊的细胞毒性作用,可对机体产生一系列的损害作用,其中对胰岛β细胞的损伤是引发糖尿病的一个重要因素［7］。
   
　　糖尿病性心肌病变是糖尿病常见的慢性并发症,随着病程的延长出现心肌细胞受损和心功能异常,临床主要表现为充血性心力衰竭、心绞痛、心律失常等。其病理改变主要是心功能的降低、心肌细胞肥大、心肌纤维化和细胞凋亡及微血管病变等［8］。
   
　　Zn 作为机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其水平的提高势必有利于这些酶活性的提高。Zn 对细胞保护作用的途径之一,是基于控制过氧化作用,其作用机理,可能是竞争性结合膜蛋白上的巯基,有效地抵制它氧化成二硫键,阻止脂质过氧化反应,从而保护细胞膜的稳定性。VE 作为第一线的抗氧化保护剂阻止脂质过氧化,在自由基进攻的早期,通过在生物膜中的自由基瘁灭作用,保护细胞膜中的多不饱和脂肪酸。含硒的谷胱甘肽过氧化物酶可在脂质过氧化物破坏细胞膜前就把它们清除掉。VE 作为天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,促进机体正常发育,保护细胞膜稳定具有重要作用。VE 的分子结构上其酚羧基的氢原子可提供给自由基,使之还原成脂质氢过氧化物阻断生物膜上多不饱和脂肪酸的自身过氧化。并且VE 还可结合生物膜上,保护生物膜免受自由基的攻击和氧化损伤。同时VE 能增强GSH2Px 的活性,并与GSH2Px 协同地终止脂质过氧化及与磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶一起抑制微粒体膜磷脂过氧化。 
   
　　环氧化酶又称为前列腺素内过氧化合成酶,前列腺素H合成酶,是催化花生四烯酸转变为前列腺素的限速酶。哺乳动物的环氧化酶至少有两种形式:COX?1和COX?2,它们都是完整的膜结合蛋白。但在细胞内部的定位不同:COX?1位于内质网,而COX?2位于核膜和内质网(主要为核膜)［9］。功能上也存在差异,COX?1属于结构型基因,在多种正常组织和细胞中表达,维持细胞的正常生理功能;COX?2属于诱导型,静息时不表达,但可以在细胞因子,激素,致癌物质等多种诱导因子的刺激下快速表达,参与多种病理生理过程［10］。近年来研究表明,COX?2不仅与病理生理过程有关,与肿瘤的发生也有密切的联系。COX?2的高表达与糖尿病并发症的发生密切相关。Komers等［11］研究认为,肾皮质COX?2蛋白的高表达与肾血流动力学改变密切相关,介导了糖尿病肾病的高滤过状态。Zuo等［12］的研究发现,COX?2选择性抑制剂莫可比对糖尿病肾病具有保护作用。但COX?2在糖尿病心肌细胞中的表达研究不多。
   
　　本实验通过免疫组织化学的方法观察到: 正常对照组心肌细胞内COX?2呈低表达, 糖尿病对照组心肌细胞内COX?2呈高表达；糖尿病补锌组和糖尿病补VE组心肌细胞内COX?2呈低表达；糖尿病补Zn+VE组心肌细胞内COX?2呈低表达。实验结果提示:心肌细胞作为非炎症相关细胞,在高血糖刺激下,也可出现COX?2表达活性的增强。而体糖尿病补Zn+VE组心肌细胞内COX?2呈低表达,提示Zn+VE联合使用可使糖尿病导致的心肌细胞内COX?2的活性降低,从而起到对糖尿病性心肌病变的保护作用。

【】
  　1 Logroscino G,Kang JH ,Grodstein F. Prospective study of type 2 diabetesand cognitive decline in women aged 70-81 years. BMJ, 2004, 328:548.

　　2 Hassing LB , Grant MD ,Hofer SM,et al . Type 2 diabetes mellitus contributes to cognitive decline in old age :a longitudinal population -based study. J Int Neuropsychol Soc ,2004 ,10 :599～607.

　　3 KJ SALE,HN JABBOUR.Cyclooxygenase enzymes and prost aglandins in pathology of the endometrium.Reproduction,2003,126:559～567.

　　4 Sharma A , Kharb S ,Chugh SN ,et al. Evaluation of oxidative stress before and after control of glycemia and after vitamin E supplementation in diabetic patients. Metabolism ,2000 ,49 (2) :160～162.

　　5 Waczulikova I ,Krahulec B ,Sikurova L. Effect of vitamin C and Eon nonenzymatic glycation and physioco?chemical properties of isolated erythrocyte membrances in diabetic patients. Bratisl Lek Listy ,2000 ,10 (3) :152 ～156.

　　6 Peila R ,Rodriguez BL ,Launer LJ . Type 2 diabetes ,apoE gene ,and the risk for dementia and related pathologies : The Honolulu2Asia Aging Study. Diabetes ,2002 ,51 :1256～1262.

　7 Xu WL ,Qiu CX,Wahlin A ,et al . Diabetes mellitus and risk of dementia in the Kungsholmen project :a 62year follow2up study. Neurology ,2004 ,63 :1181～1186.

　　8 Messier C ,Awad N ,Gagnon M. The relationships between atherosclero?sis ,heart disease ,type 2 diabetes and dementia. Neurol Res ,2004 ,26 :5672～572.

　　9 Jean Sirois, K Hampoune Sayasith, Kristy A ,et al. Cyclooxygenase?2 and its role in ovulation:a 2004 account. Human Reproduction Update, 2004, 10:373～385.

　　10 Anna Fagotti, Gabriella Ferrandina, et al. Analysis cyclooxygenase?2 (Cox?2) expression in different sites of endometriosis and correlation with clinico?pathological parametes. Human Reproduc?tion ,2004,19:393～397.

　　11 KomersR, Lindsley JN, Oyama TT, et a.l Immunohistochemical and functional correlations of cyclooxygenase?2 in experimental diabetes. J Clin Invest,2001,107(3):889～898.