哮喘大鼠血管内皮生长因子表达与γ?干扰素、白介素?4变化的相关性及地塞米松的干预

【摘要】  观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、γ?干扰素（IFN?γ）、白介素?4（IL?4）在大鼠哮喘急性模型中的表达情况，探讨Th细胞亚群的失衡与其表达的相关性。方法：36只清洁级雄性SD大鼠随机分为生理盐水对照组（C组）、哮喘组（A组）和地塞米松干预组（D组），以卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏激发法制备大鼠哮喘急性模型，末次激发24 h后腹腔注射麻醉，心脏取血，右肺行支气管肺泡灌洗留取灌洗液(BALF)。应用酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清和BALF中IL?4、IFN?γ和VEGF的浓度。结果：A组血清和BALF中IL?4、VEGF的水平均分别显著高于C组，D组血清和BALF中IL?4、VEGF的水平均分别显著低于A组（P<0.01），C组和D组相比差异均无统计学意义（P>0.05）。A组血清和BALF中IFN?γ的水平均显著低于C组（P<0.01），D组血清、BALF中的IFN?γ水平均显著高于A组（P<0.01）而低于C组（P<0.01）。大鼠BALF中IL?4 浓度与VEGF浓度呈显著正相关(r= 0.797， P<0.01)，IFN?γ浓度与VEGF浓度呈显著负相关(r=-0.568， P<0.01)。大鼠血清中IL?4浓度与VEGF浓度呈显著正相关(r=0.707， P<0.01)，IFN?γ浓度与VEGF浓度呈负相关(r=-0.332，P<0.05)。结论：大鼠哮喘急性模型VEGF蛋白表达显著增高，Th1细胞因子IFN?γ的表达与VEGF的表达存在负相关，Th2细胞因子IL?4的表达与VEGF的表达存在正相关。地塞米松可抑制大鼠哮喘急性模型中VEGF和IL?4的表达，可能参与抑制哮喘气道炎症和重塑的重要机制之一。

【关键词】  哮喘 血管内皮生长因子 干扰素 白介素 地塞米松

    ［Abstract］ Objective：To study the relationship between imbalance of Th1/Th2 cytokines and expression of VEGF, IFN?γ and IL?4 in asthmatic rats. Methods: Thirty six male Sprague?Dawley (SD) rats were randomLy divided into three groups on average, including asthma group (group A), control group (group C) and dexamethasone?treated group (group D). In this experiment, the rat model of asthma was established by the ovalbumin (OVA) provocation  methods. 24 hours after the last provocation, the animals were sacrificed. Blood and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were collected. The concentrations of IL?4, IFN?γ and VEGF in serum and BALF were measured by enzyme?linked immunosorbent assay (ELISA). Results: The concentrations of IL?4、VEGF in serum and BALF in group A ［(38.56±5.09) pg/mL, (22.62±4.00) pg/mL, respectively ＆ (381.81±45.45) pg/mL, (34.58±3.07) pg/mL］ were significantly higher than those in group C ［(14.39±1.13) pg/mL, (10.49±1.50) pg/mL, respectively］(P<0.01), ［(285.36±53.75) pg/mL, (22.88±3.18) pg/mL, respectively］(P<0.01); and the concentrations of IL?4、VEGF in serum and BALF in group D ［(14.98±2.48)pg/mL, (10.68±1.13)pg/mL, respectively］［(247.75±47.81)pg/mL, (22.80±2.93)pg/mL, respectively］were significantly lower than that of group A (P<0.01). No significant differences were found between group C and group D(P>0.05). The levels of IFN?γ in serum and BALF in group A were significantly lower than in group C (P<0.01). The levels of IFN?γ in serum and BALF in group D were significantly higher than in group A (P<0.01) but lower than in group C (P<0.01). There was a significant positive correlation between the concentration of IL?4 in BALF and that of the VEGF (r=0.797, P<0.01). Significant negative correlation were observed between the concentration of IFN?γ  and that of VEGF (r=-0.568, P<0.01) in BALF. The concentration of IL?4 in serum was significantly positively correlated with the concentration of VEGF (r=0.707, P<0.01). The concentration of IFN?γ was negatively correlated with that of VEGF (r=-0.332, P<0.05). Conclusions: In the rat model of asthma, the VEGF expression significantly increased. The IFN?γ expression was negatively correlated with VEGF expression. The IL?4 expression was positively correlated with VEGF expression. Dexamethasone can restrain the expressions of VEGF and IL?4 in the rat model of asthma, which may restrain asthma inflammation.

    ［Key words］   Asthma; Vascular endothelial growth factor; IL?4； IFN?γ; Dexamethasone

    支气管哮喘是当今世界最常见的慢性呼吸道疾病之一，其病因和发病机制相当复杂。通过全球哮喘创议的广泛推广，已普遍认识到哮喘是一种由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症，气道平滑肌细胞（ASMC）也在哮喘的发病机制中发挥着重要的作用。从ASMC起源的血管内皮生长因子（VEGF）在哮喘患者的气道重塑中可能起重要作用，而在哮喘急性发作时气道VEGF的表达及与气道炎症反应的关系研究甚少［1］。同时目前研究表明在哮喘患者体内存在着辅助性T细胞（Th）亚群的失衡，这可能是哮喘发病的重要机制。Th1细胞代表产物是γ?干扰素（IFN?γ），Th2细胞代表产物是白介素?4（IL?4）。探讨哮喘时IFN?γ、IL?4的变化与VEGF浓度的相关性，对研究哮喘的发病机制和防治哮喘发作可能有重要作用。

    1  材料和方法

    1．1  实验动物分组及实验方法

    健康清洁级雄性SD大鼠36只，6～8周龄，体重220～250 g，温州医学院动物中心提供，实验动物准字号为SCXK(浙2005?0019)，随机将其分成生理盐水对照组（Control，C组）、哮喘组（Asthma，A组）、地塞米松干预组（Dexamethasone?treated，D组），每组12只。参照［2］制备哮喘模型，方法：第1 d和第8 d腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液1 mL［内含卵蛋白1 mg和Al(OH)3 100 mg］致敏，各一次，共2次。第15 d开始使用空气压缩雾化器向置于密闭有机玻璃容器内的大鼠喷雾1％OVA，每天吸入30 min，连续激发2周。生理盐水对照组致敏和激发均以生理盐水替代OVA，地塞米松干预组处理基本同哮喘组，不同的是在抗原首次激发前24 h和每次激发前30 min给予腹腔注射地塞米松针1 mg/kg。

    1.2  主要试剂和仪器

    OVA，　美国Sigma公司提供；Al(OH)3，　自行配制；地塞米松，江苏涟水制药有限公司；IL?4 ELISA试剂盒、IFN?γ  ELISA试剂盒、VEGF ELISA试剂盒均由武汉博士德公司提供；空气压缩雾化器(PARI BOY 037G6000)， 德国百瑞公司；KDC?1044 低速离心机，科大创新股份有限公司；电热恒温干燥箱(型号：202?2?BS)，上海跃进医疗器械厂；电热恒温水浴箱HH W21.Cu600，上海医疗器械七厂；OLYMPUS  显微镜，　JAPAN；ELX 50自动洗板机及ELX 808IU  Bio?TEK酶标仪，　U.S.A。

    1．3   标本的制备 

    血标本的制备：末次激发24 h后，用20％乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉、开胸，行心脏抽血，血液用低速离心机以2 000 r/min速度离心20 min，留取血清，-20 ℃保留待检相应指标。BALF的制备：大鼠行颈部正中切口，分离出气管，在环状软骨处剪一“V”形小口，将5.5号头皮输液器剪去针头，插入主气管，用生理盐水进行支气管肺泡灌洗，每次5 mL，共2次，总量10 mL，待注入生理盐水后，轻轻按摩大鼠的肺组织30 s，回收BALF，记录回收的灌洗液量（保证回收率大于80％）。BALF经离心(3 000 r／min，40 ℃)10 min，取上清液-76 ℃保存备用。

    1.4  血清和BALF中IFN?γ、IL?4、 VEGF的测定

    ELISA法测定IFN?γ的含量（按试剂盒说明书操作）。方法：试剂盒平衡至室温后，取出反应板，加入标准品、BALF和血清各100 μL于相应的反应板孔中； 37 ℃孵育90 min；用自动洗板机吸去酶标板内液体，加入生物素抗大鼠IFN?γ抗体工作液100 μL，37 ℃孵育60 min；自动洗板机洗涤3次；每孔加入100 μL ABC工作液，37 ℃孵育30 min；自动洗板机洗涤5次；每孔加入100 μL显色液，37 ℃避光孵育30 min；每孔加入100 μL终止液，30 min内在450 nm处读吸光度（OD）值。以OD值为纵坐标，以标准品为横坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值确定其浓度。血清和BALF中IL?4、VEGF的测定方法：同IFN?γ的测定。

    1.5  统计学处理

    全部数据经SPSS 11.0统计软件进行分析，数据以±s表示。多组间比较采用方差分析，用Homogeneity of Variances Test进行方差齐性检验。多组间两两比较，方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Tamhane’s T2检验。两变量的相关分析用直线相关分析法分析。

    2  结果

    2.1  各组大鼠激发阶段的症状

    在激发阶段， A组大鼠表现为烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐和二便失禁等症状，严重者呼吸减慢或节律不齐，动作迟缓或俯伏不动、四肢瘫软，反应迟钝；D组大鼠上述表现不明显，C组无上述症状。

    2.2  BALF和血清中IL?4、IFN?γ、VEGF的浓度

    A组BALF和血清中IL?4、VEGF的浓度均显著高于C组（P<0.01）；D组和C组相比差异无统计学意义（P>0.05）； D组BALF和血清中IL?4、VEGF的浓度分别显著低于A组（P<0.01）； A组BALF和血清中IFN?γ的浓度分别显著低于C组（P<0.01）；D组BALF和血清中IFN?γ的浓度显著低于C组（P<0.01）；D组BALF和血清中IFN?γ的浓度显著高于A组（P<0.01）。见表1。表1  大鼠BALF和血清中IL?4、IFN?γ、VEGF的浓度注：与C组比较，*P<0.01；与A组比较，△P<0.01。实验过程中因各种原因大鼠死亡或标本不合格，故表1中鼠数与原来每小组12只不一致，下同。

    2.３  相关性分析 

    BALF中IL? 4与 VEGF浓度呈显著正相关(r=0.797，P<0.01)，IFN?γ浓度与VEGF浓度呈显著负相关(r=-0.568，P<0.01)。 血清中IL?4浓度与VEGF浓度之间呈正相关(r=0.707，P<0.01)，IFN?γ浓与VEGF浓度呈负相关(r=-0.332，P<0.01)。

    3  讨论

    哮喘的重要特征除气道慢性炎症，还有气道重塑。VEGF是气道重塑指标之一，以往的研究集中于其在哮喘重塑模型中的变化，本研究主要观察VEGF在哮喘急性模型（模型制备2周）中的变化及地塞米松干预的影响。

    　　本实验SD大鼠吸入OVA后出现不同程度烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐等症状，并伴有血清以及BALF中IL?4表达的增高，提示哮喘大鼠模型确实存在Th细胞亚群失衡， 体现“Th2优势应答”，与报道［3］基本一致，表明哮喘模型复制成功。

    3.1  IL?4、IFN?γ在支气管哮喘发病中的作用

    IL?4又名B细胞生长因子，是一复杂的糖蛋白，分子量约为12～20 KD。它可以诱发T细胞增殖，使未定型T细胞分化为Th2细胞。Th2细胞因子如IL?4、IL?5、IL?10及IL?13可诱导B细胞分化为浆细胞，进而产生IgE、IgG4， 参与哮喘变态反应性炎症的发生和。IgE是哮喘变应性炎症的基础，IL?4对IgE有上调作用，IL?4还可促进肥大细胞生长， 后者则是哮喘气道炎症反应的重要效应细胞。

    Th1细胞的代表产物IFN?γ，能抑制IL?4、IL?5等细胞因子的产生，进而抑制IgE的产生和嗜酸粒细胞活性，抑制速发性变态反应（IAR）和迟发性变态反应（LAR），是哮喘免疫调节中的一个重要的抑制因子。IFN?γ和IL?4是一对互相拮抗的细胞因子。大量研究表明，哮喘患者的IFN?γ产生较正常对照组明显减少，对IL?4和IgE的生成调节作用减弱，引起异常的免疫应答。

    本实验发现，哮喘组大鼠血清和BALF上清中IL?4表达水平较对照组明显升高(P<0.01)，而IFN?γ表达水平较对照组明显降低(P<0.01)，证明哮喘中存在Th1/Th2细胞亚群功能失衡，Th2细胞功能亢进。

    同时实验结果还表明哮喘组大鼠血清和BALF中IFN?γ的表达明显减少，而IL?4的生成显著增多，进一步证实哮喘大鼠存在Th1/Th2细胞失衡。证明哮喘时IFN?γ的产生不足，其抑制Th2细胞分化的作用减弱，间接促进了Th2细胞功能的相对亢进。

    3.2  VEGF与哮喘的关系

    VEGF广义上是指以VEGF?A为首的一大家族，还包括VEGF?B、VEGF?C、VEGF?D 和胎盘生长因子（PLGF）。通常所说的VEGF即是VEGF?A，分子量为34～46 KD。人VEGF基因定位于染色体6p21.3，基因全长14 Kb。 VEGF是目前发现的最强烈的血管通透因子，其浓度在1 nmol/L以下即可发挥比相同浓度组胺强50 000倍的作用。

    哮喘时存在多种细胞因子和生长因子的分泌，导致血管和平滑肌细胞的增生，细胞外基质(ECM)的沉积，参与气道重塑的过程。Knox 等［4］报道了ASMC表达VEGF 121、165、189、206亚型及不断分泌VEGF蛋白，其分泌增加是通过哮喘致炎介质缓激肽的后转录机制实现的，缓激肽诱导的VEGF分泌依赖于缓激肽β２受体，活化蛋白激酶C，产生内源性前列腺素。这是首次报道缓激肽能增加VEGF分泌并首先表明气道ASMC产生VEGF。Wen等 ［5］研究认为哮喘患者ASMC以浓度依赖的形式在Th2细胞因子IL?4、IL?5和IL?13等作用下可增加VEGF的产生，Th1细胞因子IFN?γ则有抑制VEGF生成效应。Kazi等［6］ 研究表明，ASMC起源的VEGF可通过调节ECM的生成而在哮喘患者的气道重塑中可能起重要作用，而VEGF刺激ASM纤维连接蛋白的分泌与细胞外信号调节激酶（ERK）的活化有关，且PDGF、TGF?β、IL?1β和PGE2可增强ASMC的VEGF分泌效应。上述研究均认为VEGF在哮喘患者的气道重塑中可能起重要作用。

    本实验为急性模型，结果表明，大鼠哮喘组血清和BALF中VEGF的浓度均较对照组明显升高，提示在急性发作时存在气道VEGF的表达升高。本实验结果显示大鼠BALF和血清中的IL?4浓度与VEGF水平呈显著正相关，BALF和血清中IFN?γ浓度与VEGF水平呈显著负相关，提示在哮喘急性发作时存在Th1/Th2 的失衡，且Th1/Th2 的失衡与VEGF的表达存在明显的相关性。

    同时本实验结果表明，哮喘组IFN?γ表达显著下降，而IL?4则明显增加；地塞米松组IFN?γ的表达较哮喘组明显上调，IL?4、VEGF则显著下降，提示地塞米松可调节Th1/Th2的平衡及抑制VEGF的表达。这一研究对完善哮喘的发病机制和防治哮喘的发作可能有重要作用。

【文献】
  ［1］ Yong CL， Hern KL. Vascular endothelial growth factor in patients with acute asthma ［J］. J Allergy Clin Immunol，2001， 107： 1106?1107.

［2］ 李昌崇， 胡晓光， 陈小芳， 等． 牛膝多糖对幼年哮喘大鼠气道炎症的影响［J］． 中华结核和呼吸杂志， 2003， 26（10）： 644?645.

［3］ Palmans E， Vanacker NJ， Pauwels RA， et al. Effect of age on allergen induced structural airway changes in brown Norway rats ［J］. Am J Respir Crit Care Med， 2002， 165 (9)： 1280?1284.

［4］ Knox AJ， Corbett L， Stocks J， et al. Human airway smooth muscle cells secrete vascular endothelial growth factor：up?regulation by bradykinin via a protein kinase C and prostanoid ?dependent mechanism ［J］. FASEBJ， 2001， 15(13)： 2480?2488.

［5］ Wen FQ， Liu X， Manda W， et al. TH2 Cytokine?enhanced and TGF?beta?enhanced vascular endothelial growth factor production by cultured human airway smooth muscle cells is attenuated by IFN?gamma and corticosteroids ［J］. J Allergy Clin Immunol， 2003， 111(6)： 1307?1318.

［6］Kazi AS， Lotfi S， Goncharova EA， et al. Vascular endothelial growth factor?induced secretion of fibronectin is ERK dependent ［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2004，286(3)： 539?545.