自体外周血干细胞与骨基质明胶复合移植治疗兔桡骨缺损的实验研究

                   作者：张小舟　刘秀平　邹三明　王以强　王群涛

【摘要】 目的 观察自体外周血干细胞/骨基质明胶海绵(APBSC/BMG)复合移植骨缺损的疗效。方法 36只家兔双侧桡骨做成长度1.2cm的骨缺损,随机分为每组18只。分别进行X线、生物力学以及组织学的对比研究。 结果 术后第3、6、9、12周,X线观察,改进的Gary评分及光镜观察结果显示,APBSC/BMG组优于BMG组;术后第14周,APBSC/BMG组整骨破坏载荷和骨缺损修复形态学评分均明显优于BMG组。结论 APBSC/BMG在BMG的骨形态蛋白诱导下具有明显的成骨作用,因此APBSC/BMG复合移植治疗骨缺损的疗效优于单纯BMG移植。
　　【关键词】干细胞 骨移植 骨折愈合 
　　【Abstract】Objective To observe the effect of repairing segmental bony defects by the grafting of autologous peripheral blood stem cells (APBSC) andbone matrix gelatin, (BMG) .Methods 36 rabbits were randomly into two groups: APBSC/BMG (group A) and BMG (group B),each group includes 18 rabbits.all the radius of rabbits were made to 1.2cm defects.comparative researchs were made by X-rays ,biomechanics and histology.Results group A is better than group B by X-ray obersation ,Gary evaluation grading and obersation result of telescope 3,6,9,12 weeks after operation. group A is better than group B too in total bone destroying load and morphology grading14 weeks after operation.Conclusion APBSC/ DBM caneffectively promote osteogenesis through conduct of BMP(bone morphlogy protein) and it is a new method for the repair of bony defects.
　　【Key words】Stem cell;Bone tansplantation;Bone fracture healing
　　
　　骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)是一种临床常用的骨移植材料。我们采用自体外周血干细胞(autologous peripheral blood stem cell,APBSC)与BMG复合移植修复骨缺损进行了实验研究,本实验取材简单，在实验中进行了X线检查，生物力学试验，组织学检查，效果理想，达到了预期目的，在临床有广阔的应用前景。现报告如下。
　　1 材料和方法
　　1.1 实验材料
　　1.1.1 BMG的准备 家兔6只,体重2.0~2.5kg，雌雄不限，于耳缘静脉注射10ml空气栓塞处死。取出股骨干，切除两干骺端，剔除附着骨干的软组织及骨膜，刮净髓腔，用生理盐水反复冲洗3遍，经脱脂、脱钙及去除部分水溶性蛋白制成BMG，冻干、C060灭菌备用^［1］。术前30min置于生理盐水中。
　　1.1.2 APBSC的采集^［2］及APBSC/BMG复合物的制备:家兔术前3天，按50ug/kg体重从耳缘静脉注射粒细胞集落刺激因子(日本ChuGAL制药有限公司)，每天1次。手术前从股静脉抽血8mL，先注入干燥的抗凝试管中摇匀，然后缓慢注入含有等量淋巴细胞分离液Ficoll-Paque(Amersham公司)的试管中，用400g速度离心40min后可见试管内分为4层:最上层为淋巴细胞分离液层;第二层为单个核细胞层(不透明，略混浊);第三层为血清层;第四层为红细胞层。用吸管吸出最上层，弃之。吸出第二层注入另厂无菌干燥的试管中，加入等量生理盐水，用相同的速度再离心5min，吸出底层的单个核细胞层，将其注入10ml含1:1000000肝素的生理盐水中，吹打成细胞悬液，把BMG放入上述混合液中留置30 min，制成APBSC/BMG复合物备用。
　　1.2 分组与造模 健康成年家兔36只，体重2.5~3.5kg，雌雄各半。随机分为2组，每组18只。BMG组(n=18):全麻后双侧前肢各做一2.5cm长的皮肤纵形切口，沿肌间隙分离至桡骨。用骨膜剥离器分开尺骨与桡骨之间的骨间膜，剥离挠骨中段骨膜 1.5cm长，锯断1.2cm长，造成骨缺损，将BMG分别移植到两侧骨缺损处。BMG与饶骨近、远端骨干在髓腔各套接0.1cm，不做内固定，逐层缝合，关闭切口。
　　APBSC/BMG组(n=18):骨缺损造模方法与BMG组相同，将 APBSC/BMG复合物分别移植到两侧骨缺损处。BMG与桡骨近、远端骨干在髓腔各套接0.lcm。将剩余的混合液约0.4mL抽出，分别注 入两侧BMG髓腔内，不做内固定，逐层缝合，关闭切口。
　　1.3 检查方法 术后第3、6、9、12周每组动物先行X线检查，其申术后第3、6、9周每组各取2只动物进行组织学检查。术后第12周所有剩余动物X线检查后，生物力学检查，最后行组织学检查。
　　1.3.1 X线检查 全麻后用500mAX线机摄片，条件：0.25mA， 40kV。X线片按改进的GrayX线评分标准^［3］进行评分。
　　1.3.2 生物力学检查 动物空气栓塞处死后，于前肢取下整段桡骨，去除附着的软组织，在万能实验机(DCS-5000型，日本岛津公司)上用夹具将桡骨两端固定，跨度4cm，在夹具中点施加载荷，加载速度5mm/min，电脑记录破坏应力。单位用kg表示。 　1.3.3 组织学检查 空气栓塞处死，于前肢取下整段桡骨，去除附着的软组织，按照骨缺损修复形态学标准^［4］进行评分。于桡骨中段骨修复区切取0.8cm骨段，10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，行组织切片，常规HE染色，酒精脱水，二甲苯透明，然后进行光镜检查。
　　1.4 统计学处理 结果用x±s表示，采用t检验进行统计学处埋。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 X线观察 BMG组:移植后第3周原植骨组织少部分吸收。第6周原植骨组织大部分被吸收，两断端有少量骨痂形成。第9周两断端有模糊骨痂形成。第12周两断端连接不完全，新骨再生塑形差，髓腔未再通。
　　APBSC/BMG组：移植后第3周原植骨组织少部分被吸收，两断端有少量骨痂形成。第6周两断端有模糊骨痂形成。第9周两断端连接不全，新骨再生塑形差，髓腔未再通。第12周两断端连接消失不见，新骨再生塑性好，髓腔再通。术后不同时点各组改进的GaryX线评分见表1。
　　
　　2.2 生物力学测试 术后第12周三点弯曲试验，在极限负荷作用下，BMG组有9个标本骨折发生在BMG与桡骨近、远端骨连接处;另9个标本骨折发生在BMG中央。APBSC/BMG组所有标本骨折均发生在BMG中央。术后第 12周整骨破坏载荷:BMG组为(1.43±0.71)，APBSC/BMG组为(2.32±0.79)，两组比较t=3.89，P＜0.01。
　　2.3 组织学检查 BMG组：第3周有大量白细胞和淋巴细胞浸润，植骨区有岛状纤维组织长入。第6周有类骨组织形成。第9周有一部分新生骨组织和一部分成熟骨组织。第12周有大部分成熟骨组织，髓腔未再通。APBSC/BMG组：第3周有白细胞和淋巴细胞浸润，有类骨组织形成。第6周有一部分新生骨组织，新生骨小梁融合增粗。第8周骨组织基本成熟。第12周出现皮质骨结构，髓腔再通。术后第 12周骨缺损修复形态学评分：BMG组(3.75± 1.43)，APBSC/BMG组(5.17 ±0.63)，两组比较t=5.26，P＜0.01。
　　
　　3 讨论
　　
　　干细胞移植是近几年提出来的一个新概念。因为用于移植的干细胞主要采自骨髓，以往称为骨髓移植。随着血液学研究的不断深入，人们发现干细胞不仅浮在骨髓中，也存在于胚胎肝脏、脐带血以及外周血中，所以骨髓移植的概念逐渐被干细胞移植所替代。外周血干细胞具有来源于骨髓和胚胎肝脏干细胞的共同特征，它们既能不断地进行自我更新，维持其在造血组织中的一定数量;同时又有骨髓红细胞系、粒细胞系、巨核细胞系以及淋巴系细胞分化的潜力。在形态上，干细胞的大小与淋巴细胞接近，因此本实验从外周血用淋巴细胞分离液分离的干细胞就是通过分离淋巴细胞或单个核细胞来实现的^［5］。骨髓动员后，外周血干细胞各阶段的表现，用流式细胞术，体外集落细胞培养技术或动物体内实验行人类干细胞检测发现，外周血细胞内干/祖细胞含有不均一的细胞群体，即干/祖细胞不同阶段，不论是干细胞、前祖细胞及晚祖细胞均有CD34+细胞膜分化抗原，而定向祖细胞后却没有此种抗原，也就是说CD34+。细胞可以代表骨髓、胚胎肝脏、脐带血、外周血中所含有的干/祖细胞含量。正常情况下，大多数干细胞居于骨髓中，外周循环血中只有(0.2±0.1)%的CD34+。细胞，其中多潜能干细胞只占2%^［6］。为了达到移植所需要的干细胞数必须动员骨髓中的干细胞进入外周血。大量研究证明，骨髓动员后，外周血中的干细胞数能较动员前增加数十倍，甚至上百倍^［2］。主要方法有^［2］：①骨髓抑制性化疗药;②造血因子，其申，粒细胞集落刺激因子最常用;③骨髓抑制性化疗药与造血因子联合应用。本实验由于家兔造血系统正常，因此只用了粒细胞集落刺激因子。异种骨或异体骨经过脱脂、脱钙、脱蛋白处理后制成 BMG，其中含有骨形态蛋白。Chalmers^［7］提出诱导成骨的三要素是：①诱导刺激物—骨形态蛋白;②被诱导的靶细胞—间充质细胞;③有利于骨生长的血液环境。骨形态蛋白的靶细胞是血管周围游走的、未分化的间充质细胞。Redondo^［8］对鼠骨缺损模型进行组织学观察，发现BMG组基质细胞增殖情况明显高于新鲜骨组与深冷冻组，说明BMG移植在短期(3~6周)可以产生较大的骨诱导作用。Michelson^［9］用BMG给患者做足后段关节固定术，发现术后关节融合时间和融合率与自体髂骨比较没有显著性差异。由于BMG免疫原性低;生物相容性好;能在体内逐渐吸收，被新骨所替代;且来源广泛，制备简单，价格低廉，因此成为临床常用的骨移植材料。由于BMG与不用任何移植材料的空白对照组比较，其疗效已被大量报告所肯定，故本实验未设该组，不再赘述。APBSC/BMG复合移植，通过动员使骨髓中的多潜能干细胞进入外周血，既利用了外周血中的多潜能干细胞，又利用了BMG中的骨形态蛋白，诱导结缔组织中未分化的间充质细胞，使其向成骨细胞系转化。本实验发现APBSC/BMG组术后第3、6、9、12周X线观察，改进的Gray评分和光镜观察;以及术后第12周整骨破坏载荷和骨缺损修复形态学评分均明显优于BMG组。说明APBSC在BMG的骨形态蛋白诱导下有明显的成骨作用，APBSC/BMG复合移植无论在新骨形成的时间上，还是在新骨形成质量上均优于单纯BMG移植，疗效确切。我们认为APBSC /BMG复合移植具有广泛的临床应用前景，理由是:①APBSC/BMG复合移植避免了传统手术中自体采骨给患者带来的痛苦以及供区新的骨缺损等一系列并发症。对机体创伤减小到最低限度，移植物处理达到几乎无创伤。②使骨缺损修复的手术难度降低。③与同种异体骨或异种骨移植相比较，免疫排斥反应极小;与人工骨比较，BMG同时具有良好的生物相容性、生物降解性能，在体内吸收被新骨所替代。④幼儿所需移植骨材料较大或多，需从亲属体内采骨时，APBSC/BMG复合移植所需要费用不高;与己经商品化的人工骨比较费用较低。⑤BMG可塑形，APBSC /BMG复合移植不仅在骨科，还可广泛应用于颌面外科及整形外科。
　　
　　参 考 文 献
　　1 李月玲，杨彦昌，闫丽华.异体脱钙骨复合自体红骨髓修复下颌骨缺损.中华口腔医学杂志，1996，31:232-234
　　2 刘开彦，郭乃揽.自体外周血造血干细胞移植.临床内科杂志，1997，14:115-116
　　3 李孜壮，卢世璧，王继芳.缓慢复温冷冻干燥异体骨修复实验性骨缺损.中华外科杂志，1994，32:765-767
　　4 胡蕴玉，陆裕朴.不同复合异种骨修复长骨缺损的实验研究.中华骨科杂志，1990，10(增刊):74-77
　　5 张家华，黄平.血液病学.北京:人民军医出版社，1997:2000-2217
　　6 林宝爵，阮长耿.血液学现代理论与临床实践.北京:北京出版社，1998:341-353
　　7 ChalmersJ,GaryDA,Rush J.Observationontheinductionofboneinsoft Tissues.J Bone joint Surg,1995:53-56