脑缺血再灌注损伤的研究进展
【关键词】 脑血管病
脑血管病是临床常见病、多发病，是目前三大致死疾病之一、是首位致残因素，且其发病率、病死率及致残率有逐年上升的趋势，其中缺血性脑血管病占绝大部分[1]。缺血性脑血管病尤其脑缺血后的再灌注损伤，危害极大。脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemiareperfusion injury）是指脑缺血致脑细胞损伤，恢复血液再灌注后，其缺血性损伤反而进一步加重的现象。脑缺血再灌注损伤实验研究很多，许多动物均可复制模型，但大鼠应用最多。常用的大鼠实验模型有：颈动脉引流模型[2]、动脉线栓模型[3]、四血管阻断（夹闭双侧颈总动脉并阻断双侧椎动脉）模型[4]、三血管阻断（阻断基底动脉和双侧颈总动脉）模型[5]、夹闭双侧颈总动脉模型、结扎双侧颈总动脉模型[6] 、夹闭沙土鼠颈总动脉模型[7]等。上述模型各有利弊，应依研究需要选择。颈动脉引流模型方法简便易行，成功率高，造成的缺血损伤确切，不影响基底动脉和椎动脉的血流，且脑干缺血不明显，对循环、呼吸功能影响较小，加之手术在直视下进行，既能直接观察，又能方便地控制分流速度，很适合脑血流动力学及脑缺血再灌注损伤的研究。动脉线栓模型创伤小，勿需开颅，对全身影响小，脑缺血损伤程度较稳定，术后动物存活期较长，但缺点是因动物品系、体重、尼龙线粗细及头端大小、插入深度不同等因素，使堵塞大脑中动脉的最终部位难以一致，致使不同实验室用该方法复制的模型在成功率、梗死体积、蛛网膜下腔出血的发生率、动物早期死亡率等方面不尽相同。三血管及四血管阻断模型脑缺血严重，病理变化确实可靠，但操作复杂，创伤较大，对呼吸和心率的影响大，死亡率高，常需呼吸机进行人工呼吸，故该模型可用于急性脑缺血再灌注损伤机理的研究和脑复苏急救的探讨，而不适于防治脑缺血再灌注损伤药物的效价研究。夹闭双侧颈总动脉模型制作简单，但由于仍有双侧椎动脉供血，且代偿性增强，不能有效地减少脑血流量，故不适于脑缺血再灌注损伤的研究。结扎双侧颈总动脉模型在结扎双侧颈总动脉的基础上，靠药物或放血造成全身低血压，导致双侧大脑半球严重缺血。但低血压可造成心、肾和全身重要器官的缺血，使模型复杂化，不利于脑缺血再灌注损伤的研究。夹闭沙土鼠颈总动脉模型也常用，由于沙土鼠缺乏完整的Willis环，夹闭一侧颈总动脉后，可使同侧大脑半球缺血；夹闭双侧颈总动脉，可造成全脑缺血。缺血一定时间后解除夹闭，可致再灌注损伤。但沙土鼠的Willis环变异较大，缺血程度及范围难以控制。脑缺血再灌注损伤对脑的影响很大，最明显的变化是神经元损伤和脑水肿。
1 神经元代谢障碍
脑血液供应丰富，虽脑重仅占体重的1/50，但静止状态下，脑的血流量却占心输出量的1/5，而且，脑组织几乎没有能量储备，需要微循环连续灌注以供应氧和葡萄糖，方能维持其正常生理功能。可见，脑是人体中对微循环依赖性极强的脆弱器官。微循环是直接参与组织细胞物质、能量、信息传递的处所, 脑缺血再灌注时，微循环障碍，则代谢异常，最终必然导致脑功能和形态结构的改变。Hjelde等[8]研究阻断沙土鼠颈动脉后，均可见脑膜微血管明显收缩，部分微血管周围有明显渗出，再灌流后，脑膜缺血状况可得到部分改善，但仍未恢复到阻断前水平。由于脑对缺氧最敏感，神经元主要依靠葡萄糖有氧氧化提供能量，因此，脑缺血时间过长可引起神经元严重的不可逆损伤。脑缺血时，能量代谢障碍，短时间内，ATP、CP、葡萄糖、糖原即可减少，乳酸明显增加；cAMP增加，cGMP减少，再灌注后上述变化更加明显。由于cAMP上升，导致磷脂酶激活，使磷脂降解，游离脂肪酸增多；再灌注时，自由基产生增多，脂质过氧化，使生物膜严重受损。
2 细胞凋亡
研究表明[9],细胞凋亡与脑缺血性损伤关系密切，缺血再灌注后细胞凋亡介导神经细胞损伤坏死, 尤其迟发性神经元死亡。脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡的发生与缺血的类型、严重程度、再灌注时间的长短有关。刘广义等报道[10]，大鼠脑缺血再灌注后，凋亡细胞主要位于缺血周围区，损伤、坏死细胞主要位于缺血中心区，随着缺血再灌注时间的延长，缺血周围区细胞损伤、坏死逐渐加重。可见脑细胞凋亡是一个动态渐进的演变过程，其造成细胞损伤的机制与自由基产生过多和钙超载有关。
21 自由基对脑细胞的损伤作用在脑缺血再灌注过程中，可产生大量的自由基，造成脂质过氧化；而中枢神经系统富含多价不饱和脂肪酸，最易发生脂质过氧化反应，并使脂质与蛋白质大分子物质间发生交联；还可使碱基羟化或DNA断裂，破坏核酸及染色体，导致神经元损伤甚至脑细胞死亡[11]。脑缺血再灌注时自由基对神经元的损伤可能与下列机制有关：① 改变血管的反应性，损伤血管内皮细胞，破坏血脑屏障[12] 。② 细胞膜、细胞器膜的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，磷脂被降解而使生物膜变性失能。③ 细胞膜对Na+、Ca2+以及大分子物质通透性增加，脑细胞水肿。④ 线粒体破坏致能量生成障碍；溶酶体裂解释放大量溶酶，使神经细胞自溶。⑤ 促进缺血脑组织的兴奋性氨基酸释放，加速神经元的坏死。⑥ 干扰和抑制蛋白质的合成，破坏DNA的结构。
22 钙超载致脑细胞损伤正常时细胞内钙主要储存在线粒体和肌浆网内，胞浆游离钙浓度甚低。脑缺血尤其再灌注期，因为代谢性酸中毒使脑细胞内外Na+/ Ca2+交换异常、大量的自由基损伤生物膜使膜通透性增大及线粒体功能障碍等，致使脑细胞内钙超载。钙超载时，一方面刺激线粒体钙泵摄钙，使胞浆内钙向线粒体转移，过多的Ca2+与线粒体内含磷酸根的化合物结合成不溶性磷酸钙，干扰线粒体的氧化磷酸化，使ATP生成减少；另一方面，细胞内游离钙增加，可激活多种钙依赖性降解酶，导致基质水解，损伤细胞。细胞内钙超载会引起神经元功能和结构完整性的破坏，导致细胞死亡或凋亡。在大鼠海马脑片制作的神经组织氧和葡萄糖缺乏再灌注模型[13]中，用探针X线微量分析定量检测单个CA1锥体细胞中水含量和Na+、K+、Ca2+的浓度，结果发现用河豚毒素或利多卡因阻滞电压门控性通道Na+内流，可显著减少神经元内Na+和Ca2+过多聚集，并减少相应K+丢失；另外Lopachin等[14]报道，用10mmol/L尼群地平阻断 L型电压门控性Ca2+通道，减少Ca2+内流，也在一定程度上维持了CA1细胞的基本成分和水含量。因此，钙超载可能是神经元死亡的重要通路。
3 线粒体功能障碍
线粒体是细胞的能量转换器，三羧酸循环、电子传递及氧化磷酸化均在线粒体内进行，由于脑缺血尤其缺血后的再灌注，导致大量自由基产生及细胞内钙超载，线粒体可作为亚细胞靶标而受到损害。由于线粒体呼吸功能障碍，使ATP合成减少，影响脑细胞的能量供应，而且，可出现线粒体DNA表达紊乱。动物实验表明[15]，在脑缺血再灌注初期，CA1区锥体细胞mtDNA表达下降，细胞色素C氧化酶1mRNA水平下降，同时再灌注期出现线粒体RNA、部分线粒体DNA编码的蛋白降低，影响呼吸链功能。此外，线粒体酶的活性改变，线粒体穿梭系统功能障碍，神经元能量耗竭。而且，线粒体膜磷脂降解，又可激发一系列反应，最终线粒体肿胀、甚至崩解。总之，线粒体功能下降，导致细胞代谢水平降低，最终造成神经元细胞迟发性死亡。
4 多巴胺的毒性作用
脑内多巴胺（DA）主要分布于黑质纹状体系统。多巴胺合成后储存于囊泡中,神经元兴奋时以“胞裂外排”的形式释放。研究表明[16]，脑缺血时多巴胺的释放有钙依赖性和非钙依赖性两种形式。缺血再灌注后多种因素所致的细胞内钙超载,可促进多巴胺释放。同时，由于能量耗竭、Na+k+ATP酶活性降低、细胞内钠离子浓度升高，DA可以非钙依赖性方式反向转运多巴胺,参与多巴胺的释放，导致细胞外多巴胺蓄积。多巴胺及其代谢产物均具有神经损伤作用。多巴胺的毒性作用主要包括：多巴胺自身的神经毒性；多巴胺代谢产物的神经毒性；增强兴奋性氨基酸的毒性；诱导神经元凋亡等。
5 脑水肿
脑缺血再灌注后，细胞膜损伤、兴奋性氨基酸的毒性及中性粒细胞活化等多种因素可促进脑水肿的发生。
51 细胞膜损伤脑缺血缺氧时，脑组织内ATP生成减少，使Na+K+ATP酶活性降低，导致细胞内K+大量外流，Na+、Cl及Ca2+大量流入细胞内。由于Na+、Cl的流入，使细胞内H2O明显增加，而致细胞毒性脑水肿。同时，由于脑缺血再灌注后，氧自由基产生增多，引起膜损伤，造成膜通透性增加，引起细胞膜对Na+、Ca2+及大分子物质的通透性增加，也可发生细胞毒性脑水肿。此外，由于代谢性酸中毒，细胞内H+含量增加，促使Na+、H+交换，使更多的Na +流入细胞内，更加重了脑水肿[15]。
52 兴奋性氨基酸的毒性作用兴奋性氨基酸（excitatory amino acids, EAAs）是兴奋性神经递质，神经系统内EAAs主要有谷氨酸、天门冬氨酸、乙酰胆碱等， EAAs是引起脑缺血再灌注损伤的重要途径之一。EAAs造成的神经元毒性作用主要包括两个方面：① 缺血后EAAs介导大量Na+、Cl-及H2O内流，造成脑水肿；② 通过激活N甲基D天门冬氨酸（NMDA）受体，介导Ca2+大量内流，导致细胞内Ca2+超载，激发一系列瀑布样病理生理过程，进一步导致神经元的迟发性死亡[17]。由于EAAs递质谷氨酸增多，产生兴奋毒性，作用于细胞膜上的1氨基3羧基5甲基4异戊丙酸(AMPA)受体和K+受体，使其对Na+通透性增加，Na+大量内流，且由于Na+K+ATP酶活性下降，Na+不能泵出细胞外，细胞内Na+浓度上升，产生膜电位的改变，Cl-顺电位差大量内流，Cl-2006年10月韩 敏等：脑缺血再灌注损伤的研究进展第5期2006年10月河北北方学院学报（医学版）第5期的内流又促进阳离子进入以维持电中性。Cl-和阳离子的进入导致大量水内流，造成神经元的急性肿胀，发生细胞毒性脑水肿。
53 中性粒细胞活化的损伤作用脑缺血再灌注损伤最早的反应是局部白细胞积聚及炎性细胞因子的出现和增多[18]。白细胞的激活，可释放大量促炎的细胞因子，脑缺血再灌注时，星形胶质细胞、小胶质细胞及血管内皮细胞均能产生细胞因子，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素1（interleukin1, IL1）、白细胞介素8（IL8）等。TNF在缺血后炎症反应中的启动作用已被普遍认同，魏氏研究发现[19]，大鼠脑缺血再灌注3h，缺血皮质区神经元内TNF表达增加，再灌注6h神经元内表达继续增加达高峰。TNF是具有多效性作用的促炎性细胞因子，能通过促凝血、增加内皮细胞通透性、诱导粘附分子或其他炎症介质表达，加重脑缺血再灌注损伤。IL1、粘附分子等可促进白细胞和内皮细胞粘附而激发炎症反应，进而浸润至缺血再灌注区，参与缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注的白细胞粘附、聚集、浸润，产生大量蛋白水解酶、氧自由基和花生四烯酸代谢产物，导致脑毛细血管及其基底膜损害，从而损伤血脑屏障[20]。中性粒细胞在活化、粘附过程中可释放出毒性产物和具有破坏性的蛋白酶，其中弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）对血管基膜具有非常强的破坏力，使微血管通透性增高，引起血管源性脑水肿。此外，炎性免疫机制、细胞因子、补体等因素在脑缺血再灌注损伤中也起着很重要的作用。
54 基质金属蛋白酶（MMP）的水解作用MMP是一组同源的锌、钙依赖性中性蛋白酶，其中明胶酶A（MMP2）和明胶酶B（MMP9）可降解基底膜的细胞外基质成分，分解Ⅳ型、Ⅴ型胶原、纤维连接蛋白、弹性蛋白和变性的基质胶原，加重血管源性脑水肿的形成[21]。研究表明，作为第二道屏障的基底膜对维持血脑屏障功能具有重要作用，缺血再灌注损伤后，TNF通过一系列转录因子诱导cjun、cfos原癌基因表达，促进MMP9的转录，引发血管下基底膜细胞外基质成分的蛋白水解，促进基底膜降解，使血管通透性增高，导致脑水肿[22]。
55 水通道蛋白的作用水通道蛋白（aquaporin, AQP）是一组水选择性细胞膜转运蛋白，可以增加细胞膜的水通透性。AQP家族中的AQP4与脑水肿有着密切的关系，它主要分布在中枢神经系统胶质细胞膜、侧脑室及导水管的室管膜细胞和脉络丛上皮等处，对水的代谢、分布和渗透压的调节发挥重要的作用。在急性水中毒和脑缺血时，可检测到AQP4的表达增加[23]。在大鼠双侧大脑中动脉闭塞所致的缺血性脑水肿模型研究显示，在动脉闭塞的第三天，位于皮质梗死周围的分子层和外颗粒层可见AQP4mRNA表达增强，尤以梗死灶周围明显，而且AQP4表达与脑水肿的程度呈正比关系[24]。脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理过程，包括缺血期的原发性损伤和再灌注期的继发性损伤，其始动因素是脑组织缺血缺氧，但再灌注后所造成的损伤不仅于此，更与自由基损伤、细胞内Ca2+超载、白细胞积聚、炎性细胞因子的损伤、兴奋性氨基酸的神经毒性作用、缺血区的代谢障碍以及水电解质紊乱、基因表达异常等因素有关。而且，这些因素或环节互为因果或相互影响，最终导致神经细胞损伤、凋亡、坏死及脑水肿。其中，自由基连锁反应是脑缺血再灌注损伤的核心环节，而钙超载则可能是导致神经元死亡的最后通路。
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