慢性胃炎胃粘膜组织幽门螺杆菌感染与π类谷胱甘肽S?转移酶的相关性研究
作者：高会斌 齐维娟 魏阿平 邢立强 邹玉安 薄爱华 姚树坤
【摘要】 目的：探讨谷胱甘肽S?转移酶（GST?π）在慢性胃炎持续幽门螺杆菌（H Pylori）感染胃粘膜组织中的变化及其与H Pylori感染的关系。方法：将内镜及胃粘膜活检病理证实的138例慢性胃炎（其中慢性浅表性胃炎96例，慢性萎缩性胃炎42例），分别用13C呼气实验及病理切片改良Giemsa染色检测H Pylori，按H Pylori检测结果分为H Pylori阳性组(87例)及H Pylori阴性组(51例)；用S?P免疫组化检测GST?π，观察与比较两组间胃粘膜组织中GST?π的表达，各组GST?π表达率，将所得结果输入spss统计学软件进行统计学处理。结果：本研究H Pylori阳性87例，平均阳性率63?04%;GST?π阳性共58例，平均阳性率为42?01%。其中慢性浅表性胃炎组H Pylori阳性61例，阳性率为63?54%；慢性萎缩性胃炎组H Pylori阳性26例，阳性率为61?91%，两组间H Pylori阳性率无显著差异（χ２=－0?0006，P>0?05）。慢性浅表性胃炎组GST?π阳性37例，阳性率为38?54%；萎缩性胃炎组GST?π阳性21例，阳性率50%，两组间阳性率无显著差异（χ２=1?14，P>0?25）。两组合并后H Pylori阳性亚组中GST?π阳性率为32?18%显著低于H Pylori阴性亚组的GST?π阳性率58?82%(χ２=8?30，P<0?005)。结论：持续H Pylori感染可降低胃粘膜GST?π的表达，削弱GST?π对胃粘膜损伤的保护作用。
【关键词】 幽门螺杆菌;谷胱甘肽S?转移酶π;慢性胃炎
慢性胃炎是多发病，其长期持续不愈不仅是困扰临床的一大难题，也是引起胃粘膜肠上皮化生和不典型增生并最终导致癌变的重要启动阶段。持续幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H Pylori）感染已被公认为慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因素，与胃腺癌和胃淋巴瘤关系密切[1~3]，其确切致病机制尚不明确，可通过其产生的多种致病因子对胃粘膜造成广泛损伤。谷胱甘肽S?转移酶（Glutathione S?transferase，GSTs）是一个多功能的Ⅱ相解毒酶家族，是人体内一种重要的保护性物质，具有解毒和抗癌作用[5~8]，依GSTs同工酶亚基结构和等电点的不同，将GSTs分为α、μ、π、θ和σ等5种[9]，其中π类谷胱甘肽S?转移酶（GST?π）的机体保护作用大于其它同工酶类[10]。我们用S?P免疫组化法检测了H Pylori感染与非感染慢性胃炎胃粘膜组织中GST?π的表达，旨在探讨GST?π的多重保护作用与H Pylori致毒作用的相互关系。
1 资料与方法
1?1 仪器及试剂 日本OLYMPUS?240内镜，德国Wagner13C红外线能谱仪，日本OLYMPUS光学显微镜。13C尿素酶检测试剂购自德国Wagner北京办事处，即用型S?P免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术公司。
1?2 病例及分组 将2004?3~2005?1月于我院消化科就诊的患者，选择主诉上消化道症状6个月以上，经B超除外肝胆胰疾患，并除外1月内服用抗生素、半月内服用铋剂或制酸剂者[11~13]作为入选条件，经13C呼气检测查H Pylori，常规内镜检查及病理活检、Giemsa染色查H Pylori，将内镜及病理确诊、13C呼气检测与病检查H Pylori均阳性或均阴性（一阴一阳则剔除）作为研究对象共138例，其中男91例，女47例；年龄17~63岁，平均42岁；内镜及病理检测结果为慢性浅表性胃炎96例，慢性萎缩性胃炎42例；每组又分为H Pylori阳性和H Pylori阴性两个亚组。
1?3 研究方法
1?3?1 内镜及病理活检 所有病例由有经验的内镜医师行常规内镜检查并于病变明显处取活组织5块，活检标本入100g·L-1中性福尔马林液中固定(24h)，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作厚5~7μm切片6张裱贴在涂有蛋白甘油的载玻片上，37℃储存备用。
1?3?2 H Pylori的检测
1?3?2?1 13C呼气检测法 受检者空腹6h以上，收集0时气100mL备用，将13C尿素酶试剂溶入120mL橙汁服下，30min准时收集待测气100mL，将待测气与0时气连接13C红外线能谱仪检测孔，自动检测，生成报告，以DOB值大于2?5为阳性。
1?3?2?2 改良Giemsa法 组织切片脱蜡充分复水，入20g·L-1Giemsa染液中染色30min，洗去染液，脱水、透明、封片，油镜观察。
1?3?3 HE染色常规病理学检查 组织切片脱蜡复水，梯度乙醇脱水，水洗后入苏木素染液中染色20min，10g·L-1盐酸分色，充分水洗后10g·L-1氨水蓝化，水洗后入伊红染液中染色1min，梯度乙醇脱水，透明封片。
1?3?4 GST?π免疫组化检测 切片脱蜡复水，以30g·L-1过氧化氢灭活内源性酶，1g·L-1胰蛋白酶抗原修复，滴加正常山羊血清封闭液，滴加一抗兔抗人GST?π，4℃过夜，滴加生物素化二抗20℃~37℃20min，ABC复合物20℃~37℃20min，以上各步均以PBS充分洗涤。DAB显色，苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，高倍镜下观察。
1?4 统计学处理 采用χ２检验，用spss软件包进行统计分析，以P<0?05为有统计学差异。
2 结果
改良Giemsa染色后H Pylori为红色，呈“S”状，分布在胃小凹和腺腔中，与粘液混杂存在（图1），1个视野（×400）＞2~3条为H Pylori阳性，否则为阴性。慢性浅表性胃炎HE染色胞浆染成粉红色，胞核染成紫色，粘膜层大量淋巴细胞及单核细胞浸润（图2）；萎缩性胃炎除上述表现外，每个视野（×400）腺体数目减少＞10%，间质组织超过30%；免疫组织化学染色后，光镜下观察（×400），随机选取10个视野，以平均每个视野观察到GST?π阳性胃粘膜上皮细胞数＞5个为GST?π阳性，反之则为GST?π阴性作为判断标准。GST?π阳性表达组织中胃粘膜上皮细胞浆内棕褐色物质沉积，胞核内也可见棕色物质沉积（图3）。
2?1 两组中H Pylori阳性率以及GST?π在H Pylori阳性亚组与阴性亚组中的表达（表1、表2）
图1 － 图3 略
2?1?1 慢性浅表性胃炎组 GST?π的阳性表达率为38?54%，H Pylori阳性率为63?54%，H Pylori阴性亚组GST?π阳性表达率54?29%显著高于H Pylori阳性亚组29?51%（χ２=4?76，P<0?05）。
2?1?2 慢性萎缩性胃炎组GST?π的阳性表达率为50?00%，H Pylori感染阳性率为61?91%，H Pylori阴性亚组GST?π表达阳性率75%显著高于H Pylori阳性亚组34?62%(χ２=4?95,P<0?05)，而且GST?π着色部位除分布于细胞膜周围以外，还分布于细胞浆和刷状缘（图3）。
2?2 慢性浅表性胃炎与慢性萎缩性胃炎组间H Pylori阳性率以及GST?π表达阳性率的比较结果提示两组间H Pylori感染阳性率无显著差异；慢性萎缩性胃炎GST?π的表达水平高于慢性浅表性胃炎组，但经统计学分析两组间无显著差异；两组合并后H Pylori阴性亚组GST?π表达阳性率显著高于H Pylori阳性亚组，但慢性萎缩性胃炎组GST?π的分布较慢性浅表性胃炎组广泛。
表1 两组间GST?π平均阳性率的比较 略
表2 H Pylori阴性亚组与H Pylori阳性亚组GST?π表达阳性率的比较 略
3 讨论
H Pylori感染被认为是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因素，在急性胃炎→慢性浅表线胃炎→慢性萎缩性胃炎→肠化及不典型增生→胃癌的模式[4]中发挥启动和促进作用。目前，对H Pylori的致病机制尚不明确，许多研究证实，H Pylori所产生的尿素酶、过氧化氢酶、磷脂酶、VacA、CagA以及与所定植宿主的反应状态等因素协同作用于胃粘膜造成胃粘膜屏障破坏[14~16]。GSTs是一组具有多种功能和参与机体解毒作用的超基因家族蛋白，在清除体内毒性产物及过氧化阴离子、保护细胞稳定性及调理细胞生长、分化中起重要作用[17~19]。GSTs同工酶的表达受许多特异性有害化学诱导剂包括生物因素的调控，许多诱导剂均可影响GSTs同工酶转录活性。GST?π在正常胃粘膜组织中表达较低，且不被诱导剂诱导。GST?π在细胞内设置两层屏障，位于溶酶体内作为外围屏障，另一层位于细胞核周边，共同解除来自胞浆毒性物质的毒性作用，从而保护细胞免受损伤[26]。我们研究了慢性胃炎阶段以GST?π为代表的人体解毒系统与H Pylori致毒作用间的相互关系，H Pylori作为慢性上消化道疾病的主要生物致病因素，认为可能作为GSTs的生物诱导剂诱使GST?π表达，结果却出乎预期，在慢性胃炎阶段，GST?π表达不仅未被H Pylori感染诱导，反使H Pylori感染胃粘膜组织中GST?π的表达显著低于非H Pylori感染组织，表明H Pylori感染存在某种拮抗GST?π表达的机制，其原因可能由于H Pylori感染导致GST?π基因缺失或其中某种致病因素抑制GST?π的活性部位的激活有关[24,25]，从而削弱了GST?π的保护作用[20]，有利于H Pylori致毒物质如尿素酶、触酶、磷脂酶、VacA、CagA等对胃粘膜屏障的直接损伤；另一方面，H Pylori与宿主的炎症反应启动自由基反应链，爆发大量活性氧产物（Reactive Oxidation Spicemen，ROS）进一步加重胃粘膜屏障的破坏，并引起细胞膜及胞内大分子物质如酶、DNA等的过氧化损伤，使细胞破坏、酶失活、碱基改变[21,22]。在慢性胃炎阶段，恰恰H Pylori拮抗具有防御作用的GST?π的表达，致GST?π处于低浓度促进各种致毒物质（包括H Pylori本身）对胃粘膜屏障的破坏，H Pylori持续感染及致毒物质的累积终致胃粘膜固有腺体萎缩，增加患胃癌的危险性；而胃粘膜组织中毒性物质的积聚则诱导GST?π的表达从而使慢性萎缩性胃炎胃粘膜组织GST?π表达上调。本研究还提示，进一步研究H Pylori引起胃粘膜上皮细胞GST?π基因缺失或突变的机制以及探索H Pylori抑制GST?π的活性部位将为胃炎的有效提供理论依据。
【】
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