破伤风类毒素单克隆抗体的制备及初步鉴定
作者：张秀昌 刘芳 崔萍 孙黎 罗强 贾天军
【摘要】 目的：制备并鉴定破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，为破伤风的快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法：用破伤风类毒素做抗原免疫BALB/C小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得分泌高滴度针对破伤风类毒素的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价，用间接ELISA 和Western?blot检测单克隆细胞株的特异性。结果：通过细胞融合和克隆化，筛选出3株持续分泌抗破伤风类毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E12、1E11、1G10。间接ELISA和Western?blot检测结果表明1E12、1E11、1G10可以和破伤风类毒素发生特异性反应。结论：成功制备了抗破伤风类毒素单克隆抗体，为制备免疫诊断试剂盒和抗体药物的开发奠定了基础。
【关键词】 破伤风类毒素；杂交瘤；单克隆抗体
【ABSTRACT】 Objective: To establish and prepare hybridoma cell line secreting monoclonal antibody (McAb) against tetanic toxoid, to develop a rapid assay for Tetanus and investigate the pathogenesis of the virus. Methods: BALB/c mouse was immunized by purified tetanic toxoid. Hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies (McAbs) against tetanic toxoid were screened after the fusion of mouse splenic cells with SP2/0 cells. The Ig subtypes and titer of the McAbs were assayed with EL ISA and Western?blot assay. Results: After cell fusion and subcloning, three hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies specifically against tetanic toxoid were obtained, and respectively named as 1E12, 1E11 and 1G10. Indirect EL ISA and Western?blot assay showed that the McAbs 1E12, 1E11 and 1G10 could specifically recognize tetanic toxoid. Conclusion: The specific anti?tetanic toxoid McAbs are developed and these McAbs may be useful in the development of detection assay and basic research of the pathogenesis of Tetanus.
【KEY WORDS】 Tetanic toxoid; Hybridoma cell line; Monoclonal natibodies
破伤风梭状杆菌是引起破伤风的病原菌，当机体受到外伤，创口被污染，或分娩时使用不洁器械剪断脐带等，本菌可侵入局部创面而引起外源性感染，发芽繁殖，释放毒素,在家，新生儿破伤风死亡率可高达90%。目前对破伤风的诊断主要根据典型的症状和病史。单克隆抗体用于诊断感染性疾病具有灵敏度高、特异性强的特点，在许多疾病的诊断中已得到广泛应用。本实验首次成功制备破伤风类毒素单克隆抗体，为单抗应用于破伤风的临床诊断奠定了基础。
1 资料与方法
1．1 试剂、毒素、细胞与实验动物 破伤风类毒素由北京生物制品监定所提供。福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂购自北京市普京康生物工程技术有限公司。BALB/C小鼠购自首都医科大学动物室。SP2/0细胞由北京肿瘤研究所惠赠。聚乙二醇（PEG，MW1000，）为天津天泰精细化学品有限公司产品。HAT为美国GIBCOBRL公司产品。羊抗鼠IgG酶标抗体为北京天象鑫龙生物医学科技有限公司进口分装产品。
1.2 小鼠免疫 雌性、6周龄、17ｇ左右BALB/C小鼠，后腿肌肉及背部皮内注射破伤风类毒素免疫，第一次100μg加等量福氏完全佐剂，3周后用100μg加等量福氏不完全佐剂，7周后500μg不加佐剂腹腔注射，腹腔注射后第4天进行细胞融合。
1．3 细胞融合 腹腔注射后第4天取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%聚乙二醇作用下融合。融合后的杂交瘤细胞用含20%进口胎牛血清的HAT选择性培养基混均加入种有饲养细胞的96孔板中培养，2周后在倒置显微镜下挑选克隆孔。
1．4 ELISA筛选 以破伤风类毒素（1.5/mL）为抗原包被酶标板，封闭后加碱和杂交瘤细胞培养上清液37℃ 20min，洗涤后加HRP标记的羊抗鼠IgG（工作浓度1∶2000），37℃孵育20min后洗涤，加邻苯二胺（OPD）底物显色15min后终止反应。以上各步均以PBST洗涤3次，3min/次。同时设阴性、阳性和空白对照，筛选出能分泌抗体的杂交瘤细胞。
1．5 亚克隆化培养及腹水诱生 筛选出阳性单抗后进行常规的有限稀释直至克隆细胞抗体阳性率为100%。对最后筛选出的三株阳性单克隆细胞进行扩大培养，同时对三株杂交瘤细胞进行反复冻存和复苏，每次复苏后其培养上清液均做ELISA。复苏已建株的三株杂交瘤细胞经传代取对数生长期的细胞计数，小鼠腹腔接种5×105/只。一周后诱生采集并离心腹水得上清，用ELISA测抗体效价，置-20℃保存。
1.6 染色体鉴定 秋水仙素处理传代培养单抗杂交瘤细胞，0.075mol/L KCL溶液低渗处定、铺片，10%Giemsa染色，镜检。
1.7 单克隆抗体亚类鉴定 用鼠源性单克隆抗体亚型检测试剂盒（Sigma）鉴定。
1.8 免疫印迹（Western blot）分析 破伤风类毒素经SDS?PAGE，转膜后分别与3株单抗的腹水进行Western blot检测。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立 将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，HAT培养基选择性培养，融合率为8%（32/396），抗体阳性率为9%（3/32）,经3次亚克隆，ELISA筛选，三株杂交瘤细胞获得稳定分泌抗破伤风类毒素单克隆抗体的性能。经免疫球蛋白亚类鉴定为IgG1 亚类。培养上清效价为1∶6400，腹水效价为1∶12800。
2.2 杂交瘤细胞的克隆培养及腹水抗体诱生 杂交瘤细胞在克隆化及扩大培养过程中经过3次克隆化、亚克隆后阳性克隆率为100%。3株杂交瘤细胞株分别定名为1G10、1E11、1E12,3株细胞在扩大培养及反复冻存复苏后，其分泌特异性抗体的能力能够持续保持。取杂交瘤细胞5×105细胞悬液，对经不完全福氏佐剂预处理过的BALB/C小鼠作腹腔注射以诱生腹水。用ELISA检测到腹水抗体的最高稀释度为1∶12800。杂交瘤细胞增殖旺盛，经过反复复苏后细胞生长良好，分泌抗体性能稳定。
2.3 染色体鉴定 正常 BALB/C小鼠脾细胞染色体的数目恒定为40对；同品系的SP2/0细胞的染色体众数目为68对。杂交瘤细胞的染色体数目约为两种亲本染色体数目的总合，染色后计数为102对。
2.4 抗破伤风类毒素单抗亚类的鉴定 纯化后的抗体用鼠源性单克隆抗体亚型检测试剂盒检测后显示，制备的抗破伤风类毒素单克隆抗体均为IgG1型。
2.5 Western blot检测 破伤风类毒素经SDS?PAGE，转膜后分别与3株单抗的腹水进行Western blot检测。重复3次实验，结果均显示，1G10、1E11、1E12细胞株分泌的单克隆抗体与破伤风类毒素在约120KD处有浓迹的特异性条带出现。
3 讨论
破伤风是人畜共患的一种创伤性、中毒性传染病。其特征是患病机体全身肌肉发生强直性痉挛，对外界刺激的反射兴奋性增强。该病的病原破伤风梭状杆菌在界中广泛存在，经创伤感染破伤风梭状杆菌后，如果创口具备缺氧条件，病原体在创口生长繁殖产生毒素，刺激中枢神经系统而发病。常见于外伤、阉割和脐部感染。在临诊上有不少病例往往找不出创伤，这种情况可能是因为在破伤风潜伏期中创伤已经愈合，也可能是经胃肠粘膜的损伤而感染。该病以散发形式出现。
破伤风类毒素单克隆抗体技术的出现，将大大推动了对破伤风梭状杆菌活性物质在分子水平上的研究，如对破伤风的分子流行病学调查、快速诊断、抗原物质和致病因子的分析、以及对该病的预防和等方面，都提供了强有力的手段。
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