利凡诺对B16黑色素瘤细胞生长及MMP.2、MMP.9表达的影响

【关键词】  利凡诺

　　［摘要］目的: 观察利凡诺对体外培养的B16黑色素瘤细胞生长状态及基质金属蛋白酶.2（MMP.2）、基质金属蛋白酶.9（MMP.9）表达的影响，研究利凡诺的抗肿瘤转移作用。 方法: 用噻唑蓝（MTT）法检测利凡诺对B16黑色素瘤细胞的生长抑制率;酶联免疫吸附法检测细胞培养上清的MMP.2蛋白相对含量;免疫细胞化学染色检测MMP.2、MMP.9蛋白表达情况。 结果: MTT法检测结果显示，不同浓度的利凡诺对细胞都有明显抑制并伴有时间及浓度依赖性;6.25、12.5μg・ml-1 的利凡诺组在72h与同时段对照组比有显著差异（P<0.05）;利凡诺各药物组的MMP.2、MMP.9蛋白阳性表达随药物浓度的增加而减弱。 结论: 利凡诺可以抑制B16细胞的生长，并且具有潜在的抑制肿瘤侵袭和转移的作用。

　　［关键词］ 利凡诺;B16黑色素瘤细胞;基质金属蛋白酶;转移

　　利凡诺（ethacridine）是临床常用的皮肤黏膜消毒剂和中止妊娠药，本研究组已经发现其对S.180腹水瘤（小鼠腹水瘤）和实体瘤都有明显的抑制作用1］ 。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一种降解细胞外基质的蛋白酶，在肿瘤侵袭和转移中起着重要作用，尤其是MMP.2和MMP.92］ 。目前尚不清楚利凡诺能否通过影响肿瘤细胞MMPs的表达而抑制肿瘤的转移，我们通过观察利凡诺对体外培养的B16黑色素瘤细胞生长状态及MMPs表达的影响，进一步探讨利凡诺抑制肿瘤细胞生长的机制以及其临床应用的可能性。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料
 
　　1.1.1 细胞培养及处理  B16黑色素瘤细胞株（购自院上海细胞生物研究所）接种于含10%小牛血清和100U・ml-1 青霉素、100mg・ml1 链霉素的RPMI1640培养液中，置于37℃、体积分数为0.05的CO2 恒温培养箱中培养，每隔2～3d传代1次。实验时选取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶和0.02%EDTA混合消化液消化制成单细胞悬液。

　　1.1.2 利凡诺的配制及细胞分组  每次实验加药前取利凡诺注射液［50mg・（2ml） -1 ，江苏天禾制药有限公司，批号0306041］，用含5%小牛血清的RPMI1640培养液将其稀释至浓度分别为3.13、6.25、12.5μg・ml-1 （按体积比为18000、14000、12000稀释）后立刻使用。细胞分组为:（1）对照组，加入与实验组等体积的RPMI1640培养液;（2）实验组，按利凡诺的浓度分为3.13、6.25、12.5μg・ml-1 共3组。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞生长的形态学观察  选取对数生长期的细胞制成单细胞悬液，用RPMI1640培养液稀释，细胞浓度为6×104 ml -1 ，置于饱和湿度、37℃、体积分数为0.05的CO2 恒温培养箱中培养，贴壁并生长状态良好后按照对照组与实验组进行药物处理（见1.1.2）。加药后于24、48和72h用相差显微镜观察细胞形态。实验同时选取对数生长期的内皮细胞（ECV304，人脐静脉内皮细胞）作为对照，制成细胞浓度为6×104 ml1 的单细胞悬液，按照相同方法处理。

　　1.2.2 噻唑蓝（MTT）法  选取对数生长期的细胞调节细胞浓度为6×104 ml-1 ，接种于96孔培养板内，待细胞贴壁并生长状态良好后按照对照组与实验组进行药物处理（见1.2.1），药物处理后在同样条件下培养24、48和72h后每孔加入20μl MTT（质量浓度为5g・L1 ，用0.01mol・L -1 的PBS配制）继续培养4h，弃去孔内液体，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，在酶标仪（Multiskan MK3.353）492nm处测定光吸收值（A），每组设6个平行孔，取平均值，按以下公式细胞生长抑制率（P）:   P=（对照孔A 492 -实验孔A 492 ）/对照孔A 492 ×100% 实验同时选取对数生长期的内皮细胞作为对照，制成细胞浓度为6×10 4 ml-1 的单细胞悬液，按照相同方法处理。

     1.2.3 酶联免疫吸附（ELISA）法  采用双抗体夹心法。细胞准备和药物处理方法同上，药物处理后在同样条件下培养24、48和72h后吸取培养板内的培养上清，测培养上清中MMP.2蛋白相对含量。兔抗人MMP.2抗体（Dr Stetler Stevenson馈赠）工作浓度为11000，鼠抗人MMP.2抗体（购自福州迈新试剂公司）工作浓度为110000，羊抗兔IgG HRP的工作浓度为15000，培养上清未经稀释，四甲基联苯胺（华美公司）显色，2mol・ml -1 H2 SO4 终止反应。阴性对照以新鲜无血清培养液代替培养上清。酶标仪（Multi-skan MK3.353）450nm处测定A值，以此代表蛋白相对含量。

　　1.2.4 免疫细胞化学染色（ICC）  采用标记链霉素卵白素生物素（SP）法。选取对数生长期细胞经药物处理方法同1.2.1）后培养24h，然后用PBS冲洗3次，冷丙酮固定8min，晾干。MMP.2兔抗人多抗（Santa Cruz产品）工作浓度为150;MMP.9羊抗鼠单抗（Santa Cruz产品）工作浓度为1100，DAB显色。阴性对照为不加一抗以PBS代替的细胞片。计数细胞爬片固定方位的5个高倍视野内（玻片之左、中、右3区共取5个视野）细胞总数及阳性细胞数，后者按染色强度分弱、中、强3级，分别以1、2、3赋值。以平均每视野赋值后的阳性细胞指数（5个视野阳性细胞赋值之和除以5）的均数作比较［3，4］ 。

　　1.2.5 统计学处理  检测结果用SPSS11.5统计软件处理，计量资料以ˉx±s表示;方差齐者用t检验，方差不齐者用t′检验。

　　2 结  果

　　2.1 利凡诺对B16黑色素瘤细胞形态学的影响正常状况下B16黑色素瘤细胞在相差倒置显微镜下可见细胞形态呈多样化，从多角形、梭形到圆形，呈巢状或漩涡状排列;细胞大小不一，胞浆丰富，胞核大、呈梭形或椭圆型，位于细胞中央，可见较多核分裂相，多数细胞核浆比例大，核仁清晰，有丝分裂多。在经利凡诺处理后细胞体积变大，胞浆体积增加，核浆比例变小，细胞生长速度变慢（图1）。这种变化伴随药物浓度的增大而更加显著。正常内皮细胞在经利凡诺处理后形态没有明显变化，但生长速度变慢。 A.对照组 B.3.13μg・ml-1 利凡诺组 C.6.25μg・ml -1 利凡诺组 D.12.5μg・ml -1 利凡诺组图1 利凡诺作用24h后对B16细胞形态学的影响 ×200Fig1 Effect of ethacridine on morphology of B16cells ×200

　　2.2 利凡诺对B16黑色素瘤细胞生长的影响MTT法检测显示，3种浓度的利凡诺在72h内对B16细胞都有明显抑制，与同时段对照组相比较均有显著性差异（P<0.01，图2A）;6.25、12.5μg・ml -1 浓度 组与3.13μg・ml -1 浓度组抑制作用相比较均有显著性 差异（P<0.05，图2A）;除3.13μg・ml -1 浓度组外，其余浓度组的抑制作用在72h内均随时间的延长而增大。3种浓度的利凡诺在72h内对EC都有明显抑制，无论对照组与药物组相比较还是药物组间相比较均有显著性差异（P<0.01，图2B），且有时间与浓度的依赖性。A. 对B16细胞生长的抑制作用B. 对内皮细胞生长的抑制作用 图2 利凡诺对B16细胞与内皮细胞生长的抑制作用
   

　　2.3 利凡诺对B16黑色素瘤细胞分泌MMP.2的影响 ELISA法检测细胞培养上清中MMP.2蛋白的相对含量，结果显示72h内各浓度药物组作用后细胞分泌MMP.2蛋白含量降低，并且有浓度依赖性，比较各时段蛋白分泌的光密度值发现，6.25、12.5μg・ml略
   

　　2.4 MMP.2、MMP.9免疫细胞化学染色结果 免疫细胞化学染色阳性呈棕黄色，高倍镜下可见细胞胞浆内均匀分布的棕黄色颗粒，胞核无阳性表达;阴性对照组胞浆无着色。利凡诺各浓度药物组的MMP.2蛋白表达随药物浓度的增加而降低，高倍视野内可见细胞数目减少，阳性表达减弱，均比对照组表达弱，与对照组的差异均有统计学意义（P<0.05，表2、图3），各浓度药物组间差异无统计学意义。利凡诺各浓度药物组的MMP.9蛋白表达情况与MMP.2蛋白表达相似，也随药物浓度的增加而降低，阳性表达减弱，MMP.9蛋白表达情况与MMP.2蛋白表达相似，也随药物浓度的增加而降低，阳性表达减弱，6.25、12.5μg・  ml-1 药物组与对照组的差异有统计学意义（P<0.05，表2、图4），各浓度药物组间差异无统计学意义。

　　 3 讨  论

　　侵袭和转移是恶性肿瘤最重要的生物学行为，肿瘤细胞失控生长、血管生成、MMPs的产生和释放以及粘附分子表达等众多因素皆与此病理过程有关，其中，MMPs降解肿瘤周围的基质促进肿瘤细胞突破基底膜和其它细胞外基质屏障是侵袭和转移的关键步骤［5］ 。由于MMPs在肿瘤发生、和演进过程中的作用变得越来越明确，MMPs的抑制剂筛选和开发受到广泛重视，但即使是目前最理想的batimastat和marimastat 表2  利凡诺对B16细胞内MMP.2、MMP.9蛋白表达的影响（略）亦存在剂量依赖性副作用，诸如肌腱炎、关节炎等［6］ ，我国学者也发现了桦树皮有一定的抗肿瘤作用7］ ，因而更新的药物有待被研究开发。

　　本研究证实了利凡诺对B16黑色素瘤细胞生长具有很强的抑制作用，同时可降低MMP.2、MMP.9蛋白表达;在前期研究中我们发现利凡诺高剂量（45mg・kg -1 ・d-1 ）对S.180实体瘤的生长有明显的抑制作用（47.1%～51.4%）1］ ;本研究也发现B16细胞经利凡诺处理后，细胞体积变大，胞浆体积增加，核浆比例变小，细胞生长速度变慢。该现象表明瘤细胞的恶性度降低，出现分化成熟的形态学改变，亦即利凡诺对B16黑色素瘤细胞有一定促分化作用，这充分说明利凡诺的抗肿瘤作用是多方面的。

　　临床用于白血病的药物安吖啶（amsacrine）作用机理为插入DNA链，改变DNA的模板性能，抑制DNA合成，也抑制DNA合成酶，并干扰细胞膜蛋白的构象8］ 。利凡诺与安吖啶同属吖啶类药物，该药对瘤细胞生长和MMPs表达的抑制也可能与改变DNA的模板性能、阻碍DNA合成有关。本实验结果也显示，利凡诺对细胞生长的抑制程度较MMP.2、MMP.9蛋白表达受抑程度更明显，我们推测可能存在两种抑制机理。一种抑制机理可能与安吖啶治疗白血病相同，通过改变DNA的模板性能从而对瘤细胞的生长起到抑制作用;再有一种可能性即利凡诺会影响肿瘤细胞分泌的某些细胞因子或信号，从而使MMPs活性以及激活的量有所降低，使得肿瘤细胞的浸润生长能力明显受限。这两种抑制机理是否正确尚需进一步的探讨。

　　尽管在研究中发现利凡诺对内皮细胞生长亦有一定的抑制作用，但临床使用利凡诺引产的安全剂量为100mg，而妊娠20周时羊水量约为400ml，即250μg・ml-1 ，是本实验高剂量的20倍，即使羊水达最高量2000ml，药物浓度亦有50μg・ml-1 。说明研究中使用的利凡诺浓度是比较安全的浓度，有临床应用价值，特别是发生癌性积液时，可用来控制肿瘤细胞的生长及转移。 

　　［］

　　1］陈平圣，尹克铮，韩月明，等.利凡诺对S.180实体瘤生长的影响［J］.癌症，1996，15（3）:184.185.

　　2］PERONS S L，WATSON S A，COLLINS H M，et al.Gelatinase（MMP.2and MMP.9）expression in gastrointestinal malignancy［J］. Br J Cancer，1998，78（11）:1495.1502.

　　［3］吴浩，许杰，卢韶华.肺纤维化大鼠中基质金属蛋白酶.2的 表达［J］.中华病杂志，2001，30（6）:452.455.

　　［4］陈平圣，翟为溶，张月娥，等.缺氧、高氧对肝星状细胞基质金属蛋白酶Ⅱ表达及活性的影响［J］.中华病理学杂志，2000，31（4）:337.340.

　　［5］陈华江，王杰军.基质金属蛋白酶及其抑制物与肿瘤侵袭转移的关系［J］.国外医学肿瘤学分册，2001，28（1）:23.26.

　　［6］TIERNEY G M，GRIFFIN N R，STUART R C.A pilot study of the safety and effects of the matrix metallo-proteinase inhibitor ma-rimastat in gastric cancer［J］.Eur J Cancer，1999，35（4）:563. 568.

　　［7］叶银英，何道伟，叶文才，等.23.羟基桦木酸体外抗恶性肿瘤作用的研究［J］.东南大学学报（医学版），2001，20（3）:141.144.

　　［8］LEONTIOU C，LAKEY J H，AUSTIN C A.Mutation E522K in human DNA topoisomeraseⅡbeta confers resistance to methyl N.（4'.（9.acridinylamino）-phenyl）carbamate hydrochloride and meth-yl N.（4'.（9.acridinylamino）-3-methoxy-phenyl）methane sulfon-amide but hypersensitivity to etoposide［J］.Mol Pharmacol，2004， 66（3）:430.439.