胚胎大鼠大脑额叶皮质神经干细胞的分离、培养与鉴定
作者：徐汉荣,晋光荣,张海军,赵连东,顾宝荣
［摘要］目的:探讨从胚胎大鼠大脑额叶皮质分离培养神经干细胞(neural stem cell, NSCs)的方法及NSCS的特性。方法:将145d胎龄的大鼠额叶皮质脑组织制备成单细胞悬液，于含EGF 和bFGF 的DMEM/F12无血清培养液中培养,形成原代细胞球后，进行单细胞克隆传代扩增。 免疫荧光组化方法检测克隆球Nestin、Map2、 GFAP抗体标记情况。结果:原代培养2周后，可形成大量悬浮生长的神经球，BrdU和Nestin检测呈阳性，诱导分化后呈Map2、GFAP阳性。 结论:可从胚鼠脑皮质中分离培养纯化、扩增传代获得NSCs，经诱导后可以分化为神经元和星形胶质细胞，可作为细胞替代中枢神经系统疾病的供体来源。
［关键词］神经干细胞;纯化;诱导分化；大鼠
神经系统创伤、缺血及退行性疾病的治疗一直是困扰医学界的一个难题。人和哺乳动物体内及胚胎体内神经干细胞(neural stem cells, NSCs)的发现, 为解决这一难题点燃了新的希望。目前，众多学者从各种途径探索治疗神经系统疾病的生物材料及治疗方法［12］。NSCs是一类具有自我更新和多向分化潜能的特殊细胞。利用它不仅可以探讨神经系统发育的分子机制,也可作为细胞移植治疗中枢神经系统损伤、退行性疾病及脑肿瘤等疾病。胚胎期的NSCs 主要位于纹状体、大脑皮质、视网膜以及脊髓等部位［1,3］，目前利用细胞培养技术已经成功地从上述部位分离出多潜能NSCs。尽管NSCs 是未分化细胞,不同来源的NSCs 之间仍有差别。与中脑及脊髓起源的NSCs相比,纹状体及皮质NSCs 更适合于细胞移植替代那些因脑内疾病受损的神经元［4］。本研究以胚胎大鼠为供体,采用单细胞克隆技术选择性分离探索了大脑额叶皮质NSCs的纯化、标记、不同诱导分化方法及鉴定技术,为进一步研究NSCs 的生物学特性和NSCs移植替代治疗神经系统疾病提供生物材料及方法。
1 材料与方法
11 材料145 d 胎龄的SD大鼠由东南大学动物实验中心提供。DMEM/F12培养基为Invitrogen公司产品，B27辅助培养基、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF） 及表皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF) 均为Gibco 公司产品, 兔抗大鼠Map2和兔抗大鼠GFAP 抗体购自美国R&D 公司, 其他免疫组化试剂购自北京中山公司。
1.2 方法
121 取材与培养 无菌条件下脱颈处死大鼠，在体视显微镜下小心解剖大脑额叶皮质，机械剪碎,015 %胰蛋白酶消化10min,含10 %胎牛血清的完全培养液终止消化5min。滴管反复吹打成单细胞悬液,1000 r・min-1 离心10min。细胞重悬于NSCs 培养液, 即DMEM/F12 (1∶1), B27(体积分数为0.02),EGF (20 ng・ml-1)，FGF(20ng・ml-1)。调整细胞浓度为（4－5）×105ml-1。接种到塑料培养瓶,置于37℃、5%CO2培养箱中悬浮培养,每3~4d更换培养液1次。待原代克隆形成后再次用机械分离法制作单细胞悬液, 按5×105细胞密度接种于50ml培养瓶中,每隔7～10 d机械分离克隆传代1次，用1ml注射器(带5号针头)用力吹打混匀(同时换培养液)。采用有限稀释法单细胞克隆连续传代。将细胞接种于96 孔板, 选取只有1个细胞的孔连续观察, 将其增殖所形成的单细胞克隆机械分离成单细胞悬液,将所有细胞接种于25ml培养瓶中,待次代克隆长成后连续传代。
122 NSCs增殖与分化的标记鉴定 克隆球Nestin鉴定:将经过多次连续传代所形成的克隆细胞球接种于预先置有多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中, 培养液成分为DMEM/F12（1∶1)、B27辅助培养基(1×50)、20ng・ml-1 bFGF和20ng・ml-1 EGF, 培养7d后行免疫荧光细胞化学染色,观察NSCs 特异性抗原Nestin的表达情况。克隆球诱导分化细胞的鉴定：将经过多次连续传代所形成的克隆细胞球吹打成单细胞，调整细胞浓度为（4~5）×105ml-1接种到含5mmol・L-1无血清DMEM/F12(含20ng・ml-1 bFGF, 20ng・ml-1 EGF 及B27 辅助培养液)塑料培养瓶培养形成新的神经球。将神经球接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔板,加入20%胎牛血清的DMEM培养液贴壁生长。7d后4%多聚甲醛固定分化细胞5min,封闭液(1 %山羊血清蛋白,03% Triton100)封闭30min。加一抗4℃过夜,PBS漂洗3次,每次10min,然后加入FITC荧光素或罗丹明的相应二抗,孵育30min,弃二抗,PBS漂洗3次,每次10min,磷酸甘油封片,荧光显微镜下观察。对照组采用001mol・L-1 PBS和山羊血清分别替代一抗进行染色。
2 结果
21 细胞培养及传代原代细胞在无血清培养液中悬浮生长1 d 后,80%～90%细胞死亡，10%～19%细胞贴壁生长, 这些细胞无血清培养5～7 d后完全死亡。有小部分细胞在48h内聚集形成细胞团,生长特点为悬浮,球形,形态规则,折光性强,未见明显的细胞突起(图1A)。皮层原代细胞中混有大量间质细胞，培养液呈絮状，两周后培养液逐渐清亮，悬液中细胞间质、死细胞及细胞碎片逐渐减少。显微镜下可见大小不等且不规则的神经球，神经球贴壁生长后有部分细胞向外迁徙生长。间接免疫荧光细胞化学染色显示亚代克隆细胞球大多数为Nestin 抗原阳性（图1B）。
A. 次代克隆形成的悬浮神经球 ×100
B. 悬浮神经球Nestin免疫荧光染色 ×100
图1 悬浮神经球光学显微镜所见及免疫细胞化学染色 ×100（略）
Fig 1 Suspending neurosphere were observed.
A. by light microscopy ×100; B. by fluorescene microscopy ×100.
22 NSCs增殖与分化原代克隆及各代克隆贴壁生长后,可见少数细胞从球体开始迁徙出来。细胞形态规则,呈三角形、锥形或多角形。Nestin 免疫荧光染色发现,诱导分化24 h 内，Nestin 表达仍较强,3 d 后的细胞呈阴性反应。诱导3 d后荧光染色见典型的MAP2标记神经元及GFAP标记星形胶质细胞，但GFAP为弱阳性表达,1 周后出现强阳性表达(图2)。
3 讨论
传统观点认为,中枢神经系统的神经细胞是一种终末细胞,即细胞处于有丝分裂后状态,缺乏再生能力。神经细胞损伤后恢复非常困难,中枢神经系统的创伤、变性及退行性疾病的临床也就成为难点。20世纪90年代以来,人们逐渐从胚胎、成年动物及人脑中分离出一种未分化的多潜能干细胞。它能够长期自我更新,并具有分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特性,而称为神经干细胞。神经干细胞的发现不但打破了神经元不会再生的传统观念,而且为许多以往难以治愈的神经系统疾病(如退行性疾病、脑损伤等) 提供了新的治疗思路和途径。有报道［69］，中枢神经系统起源的神经球通过诱导分化均可形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
A. MAP2 B. GFAP
图2 NSCs增殖与分化免疫细胞化学染色 ×100（略）
Fig 2 Immunofluorescence of proliferation and differentiation of NSCS ×100
从胚鼠大脑额叶皮质分离出的细胞体外培养时，在细胞因子EGF和bFGE的刺激作用下可以持续分裂增殖，具有很强的自我更新能力。大量体外实验证实EGF和bFGF能促使神经干细胞存活和增殖。EGF促进NSCs的长期存活,而bFGF则可能对NSCs向神经元和部分向胶质细胞分化起到一定的作用［1011］。培养的神经球可在体外大量增殖、长期传代，在传代过程中子代细胞仍保持了具有自我更新、多向分化的能力，而且在生长过程中聚集成球，可以表达中间丝蛋白Nestin,是目前公认的神经干细胞的标志物。继续培养使神经干细胞分化,细胞球进一步生成一些有突起细胞,渐有突起增长,相互连接成网的现象出现,还有的细胞脱离细胞球而逐渐分化发育为较成熟的、可表达MAP2、GFAP抗原的有突起的细胞,提示额叶来源的神经干细胞具有分化为神经元和神经胶质细胞的潜能。在体外细胞培养过程中，神经球生长到一定程度，中央的神经干细胞会因缺乏营养因子的调控而死亡。因此在培养一定时间后，需要分散神经球或传代来保持细胞的活性。用酶消化法很难获取活力较强的细胞，所以本实验尽量使用机械分离法进行分散过大的细胞团块或神经球。总之，神经干细胞是一种具有广泛应用前景的干细胞，随着对其增殖和定向诱导分化机制的最终阐明，人类的神经干细胞将有望作为脑移植的供体细胞以及基因治疗的载体用于临床。
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