褪黑素对大鼠缺血再灌注后心脏功能的影响
作者：韦开福，林英忠，马业新
【摘要】 目的 探讨外源性褪黑素（MLT）对急性缺血再灌注后在体大鼠心脏功能的影响及机理。方法 36只大鼠随机分为对照组、缺血再灌注（I/R）组及缺血再灌注+褪黑素（I/R+MLT）组，I/R组 及I/R+MLT组在体大鼠心脏左冠状动脉前降支完全阻断10min，再灌15min，术中监测记录心电及血流动力学的变化，随后测定局部受损心肌中MDA（丙二醛）的含量和SOD（超氧化物歧化酶）的活性。结果 心脏血流动力学指标I/R+MLT组好于I/R组(P<0.01)；I/R组MDA的含量明显高于对照组及I/R+MLT组(P<0.01)，SOD活性明显低于对照组及I/R+MLT组(P<0.01)，I/R+MLT组MDA含量及SOD 活性与对照组差异无显著性(P>0.05)。结论 褪黑素对急性缺血再灌注后在体大鼠心脏功能具有保护作用，其机理可能与其清除自由基抗氧化作用有关。
【关键词】 褪黑激素；心肌再灌注损伤；心脏功能试验；大鼠；动物实验
Abstract： Objective To investigate the protective effects and mechanism of melatonin (abbreviated as MLT) on acute ischemia-reperfusion induced cardiac function damage in rats in vivo. Methods 36 anesthetized rats were randomly separated into 3 groups： ①control group (n=12)，without left anterior descending coronary artery (LAD) ligation and MLT; ② ischemia reperfusion (I/R) group (n=12)，LAD was ligated for 10 min and reperfused for 15 min without MLT; ③ I/R+MLT group (n=12)，MLT (10 mg/kg) was injected via peritoneum 10 minutes before LAD ligation and reperfusion.ECG and haemodynamics were continuously monitored and recorded throughout the whole process，malondialdehyde (abbreviated as MDA，lipid peroxidation product，an index of myocardium damage) and superoxide dismutase (SOD) activities were tested in the injured myocardium. Results The haemodynamics indices of contractile and diastolic functions were all better in I/R+MLT group than those in I/R group (P<0.01).The levels of MDA were significantly higher while the SOD activities were lower in I/R group，compared to I/R+MLT and control groups (P<0.01)，but no significant differences were found between I/R+MLT group and control group (P>0.05). Conclusion The data suggest that MLT protects cardiac fuction against reperfusion injury in vivo，via its properties as membrane stabilizer and oxygen free radical scavenger and improving the activities of related antioxidative enzymes.
Key words： melatonin; myocardial reperfusion injury; heart function test; rats; animal experiment
心肌缺血再灌注损伤常可引起心肌顿抑等一系列病理生理改变，目前在临床上仍然是十分常见而难以解决的问题，因此进一步进行深入研究具有十分重要的意义。褪黑素是松果体分泌的一种激素，近年来研究发现，它是一种新的强大的抗氧化剂［1］，具有直接及间接的抗氧化损伤作用，可对抗阿霉素对心脏的毒性作用［2］，但对在体大鼠心肌急性缺血再灌注后心脏功能的影响如何，目前罕有报道，笔者对这一问题进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 动物及药品试剂 36只Wistar雄性大鼠，体重180～250g，由华中科技大学同济医学院动物中心提供，褪黑素（melatonin）由美国Sigma公司提供，配成浓度为10g/L的溶液备用；丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶(SOD)试剂由南京建成生物工程研究所提供。
1.2 动物分组 36只Wistar雄性大鼠在同样的光照条件下饲养，随机分为三组：对照组(n=12)、缺血再灌注（I/R）组（n=12）及缺血再灌注+褪黑素（I/R+MLT）组（n=12），I/R组及I/R+MLT组动物在冠脉结扎前10min分别予以腹腔注射生理盐水1.0ml/kg、MLT 10mg/kg，对照组不结扎冠脉，亦予以腹腔注射生理盐水1.0ml/kg。每日手术时间为上午8：00～12：00。
1.3 模型制备 用乌拉坦（1.0g/kg）腹腔注射麻醉大鼠后固定于实验台上，将针型电极置于四肢皮下作心电监护，分离出右侧颈总动脉，将PE-50聚乙烯导管（内充满肝素生理盐水，并与压力传感器相连）插入右侧颈总动脉并送至左心室（以出现左室压力波形为标准），用于监测左室压力变化。随后作气管切开并插管，用人工呼吸机维持呼吸（频率为60～70次/min，潮气量为20ml/kg，吸呼比为1∶1.5）。稳定后开胸暴露心脏，剪开心包膜，在左冠状动脉前降支（即左心耳右下缘）下用0/6无创伤缝针穿一丝线，垫一橡皮管后予以结扎，阻断血流10min，随后剪断丝线，恢复血流再灌15min。
1.4 心电及血流动力学记录 心电信号与压力信号均经MS-302多媒体化生物信号记录分析系统（广东药学院）处理，连续同步监测记录存于硬盘，术后回放分析。
1.5 心肌匀浆制备 对照组于开胸后约30min取左心室前壁心肌制成匀浆，I/R组及I/R+MLT组于再灌15min后取左室前壁受损心肌制成匀浆，所有心肌一经取下即用冰生理盐水将血液冲洗干净，拭纸拭干，称重，以生理盐水为介质做成质量分数为10%（w：v）的组织匀浆，置于深低温冰箱备用。
1.6 MDA含量及SOD活性测定 组织匀浆中MDA含量及SOD活性按试剂盒指定方法进行测定。
1.7 分析指标 ①心肌中MDA的含量及SOD的活性；②血流动力学的指标：HR、±dp/dtmax、t- dp/dtmax、T等。HR：心率（beat/min）；±dp/dtmax： 左心室等容期压力最大变化速率（kPa/s），代表心脏收缩及舒张功能；t-dp/dtmax： 左心室开始收缩至左心室内压上升速率蜂值时间（ms）；T： 等容舒张期左心室压力下降时间常数(ms)；+dp/dtmax及t-dp/dtmax代表心脏收缩功能；-dp/dtmax及 T代表心脏舒张功能。
1.8 统计分析 采用SAS软件包进行统计分析，计量数据用x±s表示，两样本的均数比较用t检验。
2 结果
2.1 血流动力学的结果 缺血再灌注前后心率差异无显著性(P>0.05)，再灌注15min后，I/R组参数±dp/dtmax低于I/R+MLT组(P<0.01)，t-dp/dtmax、T高于I/R+MLT组（P<0.01），I/R+MLT组的参数与基础值差异无显著性，提示I/R组心脏收缩功能及舒张功能明显受损，MLT可起到保护作用，见表1。
表1 缺血再灌注后血流动力学参数（略）
注：a：与对照组相比，P>0.05；b：与I/R+MLT组相比，P<0.01
2.2 褪黑素与抗氧化损伤 心肌中MDA含量I/R+MLT组明显低于I/R组（P<0.01），而与对照组差异无显著性(P>0.05)。SOD活性：I/R+MLT组明显高于I/R组（P<0.01），稍低于对照组，但差异无显著性(P>0.05)，说明缺血再灌注引起了氧化损伤，而MLT可起到抗氧化损伤的作用，见表2。
表2 三个组别心肌中MDA含量和SOD活性的比较（略）
注：a：与I/R组比较，P<0.01；b：与对照组比较，P>0.05
3 讨论
血流重建技术的开展，冠心病患者的预后得到了极大的改善。但是，随着冠脉的再通，心肌仍然不可避免地出现再灌注损伤，再灌注损伤的直接后果之一就是心肌舒张收缩功能降低（心肌顿抑）。心肌顿抑的发生机理主要是自由基爆发性生成和钙超载。缺血再灌注时大量生成的自由基以及钙超载可造成各种生物膜、肌浆网钙转运蛋白、收缩蛋白及线粒体的损伤，从而引起心脏的舒缩功能降低，对此目前尚无有效的防治办法。
褪黑素是一种新的抗氧化剂，笔者尝试将之用于再灌注之后心肌顿抑的防治，并采用血流动力学指标来评价心功能。在实验中观察到，缺血再灌注后I/R组心肌的收缩功能明显下降，表现为+dp/dtmax降低，t-dp/dtmax延长，舒张功能亦受到损害，表现为-dp/dtmax降低，T值增加，而I/R+MLT组的各血流动力学指标改变较小与基础值相比差异无显著性，好于I/R组，表明I/R+MLT组心肌的舒缩功能由于褪黑素的存在而得到保护，本实验中大鼠的心率在缺血再灌注前后与基础值相比差异无显著性，与报道相一致［3］，排除了心率对各血流动力学指标的影响。褪黑素能维持缺血再灌注时心肌正常的舒张收缩功能可能与其具有以下作用有关：①抗氧化损伤、改善心肌能量代谢：褪黑素分子结构具有亲水及亲脂两种特性，易于通过各种生物屏障，从而在全身各器官组织细胞及各亚细胞成分、生物大分子、DNA中均可发挥抗氧化作用，使缺血再灌注时心肌细胞结构保持完整，各种蛋白质、酶的功能损伤降到最低限度，从而保证心肌能进行正常的收缩、舒张，本实验中I/R+MLT组的反应氧化损伤指标的MDA和SOD均好于I/R组，证实了这一点；②改善心肌微循环：褪黑素能抑制缺血再灌注损伤引起的微血管内皮细胞的水肿及白细胞的粘附，保护微血管内皮屏障的完整性，消除缺血再灌注时的无复流现象，维持缺血再灌注后微血管的通畅［4］，从而改善心肌的微循环；③抑制细胞凋亡：缺血再灌注时的氧化损伤、钙稳态失衡及线粒体损伤可启动心肌细胞凋亡的发生，褪黑素可通过消除这些因素而抑制凋亡的发生［5］，使心肌细胞不过多丢失，保证其正常舒张收缩的需要；④正性肌力作用：心肌细胞上存在褪黑素受体，褪黑素可通过这些受体发挥正性肌力作用［6］。
总而言之，褪黑素可防止缺血再灌注造成的心肌氧化损伤，维持在体大鼠心脏正常的舒缩功能，改善血流动力学，这对于临床有重要意义，其作用机理与其强大的抗氧化能力及相关作用有关。由于客观条件的限制，本实验未能采取多种剂量及多个时点给药干预，其量效关系及最佳作用时间，有待以后进一步探讨。
【文献】
［1］ Tan DX，Chen LD，Poegeler LC，et al.Melatonin： A potent endogenous hydroxyl radical scavenger ［J］.Endocrine J，1993，1：57-60.
［2］ Morishima I，Matsui H，Mukawa H，et al.Melatonin，a pineal hormone with antioxidant property，protects against adriamycin cardiomyopathy in rats ［J］.Life Sci，1998，63(7)：511-521.
［3］ Tan DX，Manchester LC，Reiter RJ，et al.Ischemia/reperfusion induced arrhythmias in the isolated rat heart： prevention by melatonin ［J］.J Pineal Res，1998，25(3)：184-191.
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