热休克蛋白70与心肌保护研究现状

【关键词】  热休克蛋白质70 心肌缺血 心肌再灌注损伤/

    热休克蛋白(heat shock protein, HSP)是指细胞在应激原特别是环境高温诱导下所产生的，由热休克基因所编码合成的，序列高度保守的一组蛋白质。近年来研究发现，以热、缺血缺氧为应激原或通过基因调控的方法诱导心肌细胞产生热休克蛋白，可使心肌具有抗热、抗缺血缺氧的保护作用。热休克蛋白按其分子量不同分为多个家族，其中，热休克蛋白70(HSP70)备受重视，已成为新近较重视的内源性心肌保护途径之一，在对抗心肌缺血再灌注损伤中发挥着极为重要的作用。综合近几年的研究热点，现就其特性及其在心肌保护方面的研究现状进行综述。

　　1  HSP的一般概况

    1962年Ritossa［1］首次从果蝇在热应激环境中诱导合成而命名，随后的研究发现，除高温外，缺血、低氧、重金属盐及大多数病理状态下都能诱导细胞产生热休克蛋白，因此又称应激蛋白，但习惯上仍沿用热休克蛋白这一名称。根据分子量大小和同源程度可分为HSP110，HSP90，HSP70，HSP60及小分子量HSP等几个家族，每个家族又有多个成员。HSP70是HSP家族中最保守、最主要、含量最丰富，也是近年来研究备受关注的一类。HSP70家族(分子量：72～80)成员最多，共有21种蛋白质，是一组进化上高度保守的应激蛋白。按表达情况可分为结构型HSP70和诱导型HSP70，生理情况下，正常细胞可表达结构型HSP70，应激情况下略有增加。结构型HSP70又可分为两种，即葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein, GRP78)，这种蛋白存在于内质网腔内；另一种是GRP75，主要存在于线粒体内。诱导型HSP70即HSP72，仅出现于应激细胞，通常在正常细胞中并不表达或表达量甚少，但是在热应激或其它应激原的作用下则表达迅速增加［2］。

　　2  HSP70的一般生物学特性

　　2.1  分子伴侣作用 

　　分子伴侣 (molecular chaperones, MC)是一类与其他蛋白不稳定构象相结合并使之稳定的蛋白，它们通过控制结合和释放来帮助被结合多肽在体内的折叠、组装、转运或降解等，HSP70承担着非常保守的MC功能，即帮助蛋白跨越内膜及维持蛋白的特定构象等。HSP70在应激后生成最为显著，它作为MC参与细胞内蛋白质的折叠、装配，维持某些肽链的伸展状态，以利其跨膜转位，在线粒体、内质网等不同的区域内发挥作用，在细胞的信息传递、生长、分化中具有重要的调控作用，同时它又可以促进某些变性蛋白质的降解清除，重新激活某些酶的活性，维持细胞的正常生理功能，作为一种内源性保护物质对脏器损伤产生自身保护作用［3］。HSP70作为一种伴侣蛋白，其生物学特性主要表现为加速新生多肽链的正确折叠、组装，纠正损伤蛋白的错误结构，从而维持蛋白质的合理构象；催化变性蛋白质的特异性和非特异性降解，从而保护细胞的生成和功能。研究认为，HSP70的产生机理［4］：主要与热休克转录因子(heat shock transcription factor, HSTF)和HSP基因上特异DNA片段即热休克素(heat shock element, HSE)的结合有关。在非应激状态下，HSE以单体形式存在于胞浆中，不与HSE结合。当生物体受到多种损伤性应激原刺激时，HSF作为启动子与HSE结合，启动HSP70的转录合成。

　　2.2  抗氧化及炎性损伤作用 

　　目前认为自由基的作用、细胞内钙超载及炎性细胞浸润在缺血再灌注/损伤中起重要作用。HSP70对损伤心肌保护作用与其阻止再灌注损伤时氧自由基的释放和细胞内钙反常及抗炎作用有关。心肌缺血时氧自由基产生增加，导致细胞内钙离子超载，它可以损伤细胞膜、破坏细胞酶系统、细胞核和核糖体蛋白，使血管通透性增加，离子泵衰竭，导致心肌功能失常。HSP的抗氧化作用分为如下两方面：一方面通过抑制产生氧自由基的关键酶即氧化酶，反馈减少氧自由基的产生；另一方面可增加内源性过氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)的水平，从而清除氧自由基，保护细胞。如有实验发现，缺血再灌注能引起HSP70和Mn-SOD等抗氧化基因的激活。在果蝇中也发现SOD-RNA水平的增高与HSP70 RNA表达的增高相一致。
　
　　2.3  协同免疫作用 

　　通过抑制活性氧族(reactive oxygen species, ROS)和细胞因子起到保护细胞和组织免受炎症损伤的作用。当刺激因素引起细胞免疫应答时，不但有各种细胞因子(IL-1、IL-2、TNF-a等)产生，同时亦伴有HSP的产生，以对抗细胞因子对细胞的损害作用。冉擘力等［5］发现，HSP72表达增加可使细胞粘附分子ICAM-1表达减少，从而减少PMN浸润，产生心肌保护作用。

　　2.4  抗细胞凋亡作用 

　　细胞凋亡(apoptosis)是与机体组织自稳机理有关的主动性死亡，是细胞在一定生理和病理条件下，遵循自身程序的生理性死亡。一些有害应激包括热休克、氧化应激等均可以导致细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)，即细胞凋亡。HSP可以通过两条通路阻断细胞的凋亡：①阻断细胞色素介导的凋亡通路；②抑制细胞内应激酶((jun N-teriminal kinase，JNK)的激活。不同HSP可以在细胞色素C介导的细胞凋亡通路的不同阶段起作用，如HSP27与细胞色素C结合可阻断后者与HSP21的结合［6］；HSP90与HSP21结合可阻断后者与细胞色素C的结合［7］；HSP70与细胞色素C和HSP21的复合物结合可阻断HSP29前体的活化。细胞内HSP27水平增高可以阻断信号通路，抑制应激诱导的激活，从而减少细胞的凋亡。

　　3  HSP70的心肌保护作用

　　3.1  保护心肌收缩力 

　　Tanonaka［8］等证明了热激预处理冠脉损伤导致慢性心衰大鼠模型组HSP72/R热休克同源物(heat shock cognate,HSC)73表达明显增加,其左室舒张末压力(LVEDP)、心率(HR)、心率收缩压乘积(RPP)较对照组明显降低，说明了HSP72/HSC73对慢性心衰大鼠心肌细胞收缩功能的保护作用。Jayakumar［9］等通过基因转染诱导HSP70大量表达，发现试验组移植后心脏复跳时间、LVEDP的恢复、左心室内压上升最大速率(+dp/dt max)、左心室内压下降最大速率(-dp/dt max)的恢复以及冠脉血流的恢复明显好于对照组。Nayeem等［10］利用半致死量的热休克或新陈代谢预处理培养成年大鼠心肌细胞30min,24h后用致死量的热休克及新陈代谢分别再处理两种预处理的心肌细胞，可使致死量热休克处理引起的心肌细胞损伤指数从69下降到27(用半致死量热休克预处理)和19(用半致死量新陈代谢预处理)；使致死量新陈代谢处理引起的心肌细胞损伤指数从81下降25.9(用半致死量热休克预处理)和21.4(用半致死量新陈代谢预处理)。

　　3.2  减少心肌缺血坏死范围 

　　HSP的诱导产生，已被证明和离体心肌保护有关，且可减少心肌缺血坏死范围和延迟不可逆的心肌I/R损伤的发生。Okubo［11］将单纯载体(vehicle)、腺病毒.LacZ基因(ad.LacZ)、腺病毒.HSP70(AD.HSP70)基因分别转移入兔的心肌中,然后经过30min缺血和3h再灌注，发现Ad.HSP70组的心肌梗塞面积减少到(24.5±2.8)%，而Vehicle和Ad.LacZ组分别为(41.9±2.8)%和(42.7±2.5)%。而且这种保护作用仅表现在注射部位，在非注射部位没有明显的保护作用。充分说明了通过体内兔心肌HSP70基因转移减少了I/R心肌的梗塞面积。

　　3.3  抗心律失常作用 

　　I/R心脏几乎都出现室性早搏、室性心动过速和心室纤颤等节律紊乱，尤其是体外循环下行心脏手术心脏复跳时表现更为明显，发生率占87.5％(7/8)。卢彦珍［12］等在原位及离体家兔心脏,I/R、缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)模型上分别应用蛋白激酶C抑制剂和激动剂，观察对心肌的作用和对心肌HSP70 mRNA表达的影响，结果显示IPC使心肌HSP70 mRNA表达明显高于缺血再灌注组，而心律失常发生率明显低于该组。通过IPC而诱导HSP70的产生明显降低再灌注心律失常的发生。在大鼠体内注射去甲肾上腺素诱导HSP70合成后，却促进了缺血心肌心室功能的恢复，再灌注后，实验组心肌收缩力增加，心律失常减少，心肌超微结构显示损伤减轻［13］。

　　3.4  HSP70心肌保护作用的可能机理［14］ 

　　目前认为有以下几种可能：①MC功能：HSP70可通过结合因缺血而受损的蛋白，修复并维持其结构的稳定性，从而减轻受损蛋白的破坏，达到心肌保护的作用。② 维护心肌Ca2+的稳定：最近Liu等［15］研究表明，HSP70可通过改善缺血心肌Ca2+通道内环境，减轻心肌Ca2+超载，从而提高心肌收缩力，发挥心肌保护作用。③保护心肌线粒体功能、抗凋亡作用：HSP70具有很好的膜稳定性，可通过稳定线粒体保障细胞能量代谢，从而减轻缺血-再灌注损伤［16］。Jiang等［17］发现，大鼠心肌细胞经热休克预处理后，心肌HSP70明显表达，耐受H2O2损伤的能力增强，而H2O2诱导的线粒体损伤和凋亡显著抑制。④抑制炎性细胞因子释放，发挥非特异性免疫保护作用。HSP70可通过抑制免疫活性因子如IL-1、NF-kB的转录，发挥抗缺血-再灌注损伤的效应［18］。⑤调节敏感性钾通道活性，抑制细胞膜上快钠通道开放而抗再灌注心律失常。⑥保护冠状动脉内皮细胞，调节血管平滑肌舒张功能。⑦改善心肌细胞能量代谢。⑧蛋白降解功能。

　　4  HSP70心肌保护的应用前景

    Meldrum［19］等人实验表明，经冠脉灌注将携带有HSP70基因的质粒通过脂质体输送到体内，可有效地增加HSP70的表达，并使心脏具有抵抗缺血或内毒素损伤的作用。同时越来越多的实验表明，通过药物(如五味子素、酪氨酸激酶抑制剂、七氟醚等)［20～22］诱导内源性HSP70的表达，对I/R和缺氧复氧时的心肌细胞都产生了有效的保护作用。因此，目前对于HSP的研究将突破传统方法，取而代之的将是如何寻求更为有效的基因手段将HSP基因精确传递到目标组织；同时，如何寻求通过药物手段诱导内源性HSP的表达，从而达到更为有效的心肌保护效果，为心血管疾病的治疗带来更为可靠、可控性较强的治疗手段。随着病毒载体的日益，有可能找到一种更为安全便捷的治疗方法将基因准确地传递到心脏［23］，同样，随着临床药的深入研究，将会有更好、更为可靠的新药在诱导内源性HSP表达方面有着更大的突破。

【】
  　　［1］Ritossa FM. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP Drosophila ［J］. Experientia,1962,18(1):571-573.

　　［2］Welch WJ. Manmalian stress response cell physiology, structure/ function of stress protein, and implication for medicine and disease ［J］. Physiol Rev,1992,72(4):1063-1081.

　　［3］Gusurova V, Caplan AJ, Brodsky JL, et al. Apoprotein B degradation is promoted by the molecular chaperons HSP90 and HSP70 ［J］. Bilo Chem,2001,276(27):24891-24892.

　　［4］Yu HP, Shimizu T, Choudhry MA, et al. Mechanism of cardio protection following trauma-hemorrhagic shock by a selective estrogen receptor-beta agonist:up-regulation of cardiac heat shock factor-1 and heat shock proteins ［J］. J Mol Cell Cardiol,2006,40(1):1852-1894.

　　［5］冉擘力.白细胞介素-1预适应对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制［J］.新药与临床杂志,2002,21(6):339-342.

　　［6］Garrido C, Bruey JM, Fromentin A, et al. HSP27 inhibits cyto-chrome c-dependent activation of rocaspase-9 ［J］. FASEB J,1999,13(14):2061-2070.

　　［7］Pandey P, Saleh A, Nakazawa A, et al. Negative regulation of cyto-chrome c-mediated oligomerization of Apaf-1 and activation of procaspase-9 by heat shock protein 90 ［J］. EMBO J,2000,19(16):4310-4322.

　　［8］Tanonaka K, Furuhama KI, Yoshida H, et al. Protective effect of heat shock protein72 on contractile function of perfused failing heart ［J］. Am J Physiol Heart Circ Physio,2001,281(I):H215-H222.

　　［9］Jayakumar J, Suzuki K, Khan M, et al. Gene therapy for myocardial protection transfection of donor hearts with heat shock protein70 gene protects cardiac function against ischemia-reperfusion injury ［J］. Circulation,2000,102(19 supp13):Ⅲ302-Ⅲ306.

　　［10］Nayeem MA, Hess ML, Qian YZ, et al. Delayed preconditioning of cultured adult rat cardiac myocytes role of 70- and 90- kDa heat stress proteins［J］. Am J Physiol,1997,273(2 Pt2):H861-868.

　　［11］Okubo S, Wildner Q, Shah MR, et al. Gene transfer of heat shock protein 70 reduces infarct size in vivo after ischemia/reperfusion in the rabbit heart ［J］. Circulation,2001,103(6):877-881.

　　［12］卢彦珍，王庸晋，王晓丽,等.蛋白激酶C对缺血预处理家兔心肌热体克蛋白70 mRNA的影响［J］.中国病理生理杂志，2002,18(4):406-409.

　　［13］Meng X, Brown JM, Ao L, et al. Norpinephrine induces cardiac heat shock protein 70 and delayed cardio protection in the rat through alpha 1 adreno captors ［J］. Cardiovasc Res,1996,32(2):374-383.

　　［14］杨龙，杨天和，吴立荣，等.热体克预处理对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡表达的影响［J］.中国心血管病研究杂志,2005,3(8):620-623.

　　［15］Liu J, Kam KW, Borcbert GH, et al. Further study on the role of HSP70 on Ca2+ homeostasis in rat ventricular myocytes subjected to simulated ischemia ［J］. AM J Physiol Cell Physiol,2006,290(2):C583-C591.

　　［16］Matsumori Y, Northington FJ, Hong SM, et al. Reduction of caspase-8 and-9 cleavage is associated with increased c-FLIP and increased binding of Apaf-1 and Hsp70 after neonatal hypoxic/ ischemic injury in mice over-expressing Hsp70 ［J］. Stroke,2006,37(2):507-512.

　　［17］Jiang B, Xiao W, Shi Y, et al. Heat shock pretreatment inhibited the release of Smac/DIABLO from mitochondria and apoptosis induced by hydrogen peroxide in cardiomyocytes and C2C12 myogenic cells ［J］. Cell Stress Chaperones,2005,10(3):252-262.

　　［18］Yamamoto K, Sarukawa M, Ito T, et al. An anti-ulcer drug, geranylgeranylacetone suppresses inducible nitric oxide synthase in culture vascular smooth muscle cells ［J］. J Hypertens,2005,511(2-3):109-120.

　　［19］Meldrum DR, Meng X, Shames BD, et al. Liposomal delivery of heat shock protein 72 into the heart prevents endotoxin induced myocardial contractile dysfunction ［J］. Surgery,1999,126(2):135-141.

　　［20］Chiu PY, Ko KM. Schisandrin B protects myocardial ischemia reperfusion injury partly by inducing Hsp25 and Hsp70 expression in rats ［J］. Mol Cell Biochem,2004,266(1-2):139-144.

　　［21］Morris SD, Cumming DV, Latchman DS, et al. Specific induction of the 70-kD heat stress proteins by the tyrosine kinase inhibitor herbimycin-A protects rat neonatal cardio myocytes. A new phamacological route to stress protein expression ［J］. Clin Invest,1999,97(3):706-712.

　　［22］唐英,王泉云.七氟醚和缺氧预适应诱导乳鼠心肌细胞HSP70表达的改变［J］.湖南医科大学学报，2003,28(2):129-132.

　　［23］Brar BK, Stephanou A, Wagstaff, et al. Heat shock proteins delivered with a uirus vector can protect cardiac cells against apoptosis as well as against themal or hypoxic stress ［J］. J Mol Cell Cardiol，1999，31(1)：135-146.