凋亡蛋白抑制因子livin基因siRNA表达载体的构建与转染

【摘要】  目的：构建3个针对凋亡蛋白抑制因子livin基因mRNA的小干扰RNA ( siRNA)表达载体，然后转染HCT-8/V细胞。为研究livin基因沉默对HCT-8/V细胞耐长春新碱特性的影响奠定基础。方法：合成3对靶基因livin的siRNA寡核苷酸序列通过退火生成转录模板，与线性pGCsi-H1/Neo/GFP质粒连接，转化DH5α钙化菌抽提重组质粒，测序鉴定。用脂质体2000将重组质粒转染HCT-8/V细胞并用G418筛选。结果：转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落，测序结果与所设计、合成的livin 的siRNA转录模板序列一致；在荧光显微镜下观察到HCT-8/V细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)证实重组质粒已转染入细胞并用G418剔除了未转染质粒的细胞。结论：成功构建livin基因的siRNA表达载体，转染并筛选出转染了livin siRNA表达载体的HCT-8/V细胞。

【关键词】  小干扰核糖核酸 质粒 凋亡蛋白抑制因子 转染

    [Abstract]   Objective: To construct 3 eukaryotic expression vectors of short hairpin RNA (shRNA) against livin gene and  then transfect into HCT-8/V cells, and to pave the way to research that gene-silencing of livin in HCT-8/V on trait of vincristine resistance. Methods: Three pairs of oligonucleotide based on livin mRNA sequences were synthesized and annealed to produce transcription templates, and then linked with linear plasmid pGCsi-H1/Neo/GFP to generate siRNA eukaryotic expression vectors. Plasmids were extracted following DH5α strains were transformed. Then insert sequences were identified and recombinants were transfected HCT-8/V cells. Results: The insert sequences were identical with designed shRNA template sequences according to sequencing. Expression of green fluorescent protein in transfected HCT-8/V was observed by fluorescence microscopy. Conclusions: The recombinant vectors were established and transfected into HCT-8/V cells successfully, HCT-8/V cell with expression vectors of livin siRNA was screened by G418 and proliferated.

    [Key words]   Small interfering ribonudeoacid; Plasmid; Inhibitor of apoptosis protein; Transfection

    凋亡蛋白抑制因子livin是凋亡抑制蛋白家族成员之一，livin的过表达与肿瘤的发生、和肿瘤耐药[1]有关。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种高效的基因表达阻断技术, 它通过体外合成或体内表达在靶细胞内产生与目的基因同源的含21~23个核苷酸的双链小分子干扰RNA 片段(small interfering RNAs, siRNA )。siRNA 制备方法有多种，若在哺乳动物细胞内持久表达siRNA以期长久抑制靶基因，通常采用表达载体的方法。本研究拟构建3个livin基因siRNA 表达载体,用此载体转染耐长春新碱的结肠癌细胞株HCT-8/V,为研究RNAi技术抑制livin在耐长春新碱结肠癌细胞株HCT-8/V中的表达，进一步探索livin的siRNA对逆转HCT-8/V细胞耐长春新碱的效果从而为研究肿瘤耐药的基因提供物质基础和技术准备。

    1   材料与方法

    1.1   材料   pGCsi-H1/Neo/GFP表达载体与siRNA模板退火缓冲液（上海吉凯公司），T4 DNA连接酶、内切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ（Promega公司）。PCR 产物纯化试剂盒（上海华舜公司）。高纯质粒提取试剂盒（北京天根生化科技公司）。HCT-8/V耐长春新碱细胞株、胰酶、G418（南京凯基生物公司）。RPMI1640培养基、MEM培养基和胎牛血清（上海吉泰公司）。转染试剂Lipofectmine 2000（Invitrogen公司），3对livin siRNA转录模板序列由上海生工生物工程公司合成。

    1.2   方法

    1.2.1   siRNA转录模板的设计与合成   Livin基因转录产物因剪接方式不同有两种mRNA 亚型Livin α和Livin β，两者在第六外显子差54个碱基，因此以两者序列共同部分为模板，根据GenBank报道的livin mRNA序列(Livin α为BC014475，Livin β为AF311388)用Ambion公司的siRNA在线软件设计，并根据siRNA设计原则[2]挑选3条发卡结构的siRNA序列模板，分别命名为siRNA-liv158，siRNA -liv625，siRNA-liv1234。经BLAST检索确认与livin以外的人类已知基因序列无同源性。3个靶序列和相应发卡结构模板如下:

    （1）siRNA-liv158　

    靶序列为5’- AAAGACAGTGCCAAGTGCCTG -3′，其发卡结构模板为：

    （2）siRNA-liv625

    靶序列为5’- AAGAGACTTTGTCCACAGTGT -3’ ，其发卡结构模板为：

    （3）siRNA-liv1234 

    靶序列为5’- AACTGTACCTGTTTGGATGCT -3’，其发卡结构模板为：

    1.2.2   生成双链DNA转录模板   取3mg/ml 的DNA 单链合成片段1μl ,溶解于49μl 退火缓冲液中，分别加热90℃ 4min、70℃ 10min、37℃ 15min ,退火冷却至室温,得到双链DNA 片段。

    1.2.3   构建重组质粒   pGCsi-H1 / Neo / GFP 经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,用PCR 产物纯化试剂盒除去切下的小片段，得到纯化的线性pGCsi-H1/Neo/GFP载体。取2μl 退火产物和6μl 线性化pGCsi-H1/Neo/GFP(0.3mg/ml)，然后将载体溶解在1μl 10×T4连接酶缓冲液中，加入1μl(5U) T4 DNA 连接酶，4℃过夜。

    1.2.3   重组子的转化与筛选   将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB培养基铺板，37℃培养过夜，次日挑取单个菌落于液体LB中培养增菌。

    1.2.4   重组子的鉴定与纯化   将细菌培养扩增后一部分送上海生工生物工程公司测序鉴定，余下部分采用高纯质粒提取试剂盒按厂家说明提取纯化重组质粒。

    1.2.5   细胞培养   耐长春新碱的HCT-8/V肠癌细胞用含10%胎牛血清、100mg/ml 青霉素和100mg/ml 链霉素及20mg/L长春新碱的RPMI 1640培养基于37℃、5%CO2条件下培养。

    1.2.6   细胞转染与筛选   转染前1天将对数生长期的HCT-8/V细胞按4×105个/孔接种于12孔培养板，用１ml不含抗生素和长春新碱的RPMI 1640继续培养使细胞融合达75%~85% 时进行转染。转染方法参照转染试剂Lipofectmine 2000厂商推荐方法作稍许改动，取1.6μg质粒溶于100μl MEM培养基中，取４μl转染试剂混入96μl MEM培养基静置5min后与稀释的质粒混匀，室温置20min后加入细胞培养板内，4h后用含10%胎牛血清但不含抗生素的RPMI1640换液以除去转染试剂内脂质体对细胞的毒性。转染24h、48h时在荧光显微镜下观察结果。48h后培养液换为含10%胎牛血清及400mg/ml G418的RPMI1640进行筛选，每2天换液1次。

    2   结       果

    2.1   重组质粒的筛选与鉴定   所涂平板均有菌落形成，纯化的重组质粒以H1启动子为上游引物作单向测序，所测得序列为质粒的反义序列，测序证实3个重组质粒的插入序列与设计的siRNA 转录模板序列一致。

    2.2   观察转染与筛选情况   在转染24h、48h后用Leica 公司的DMI IRB4000 倒置荧光显微镜可见明显的绿色荧光，通过计数得出转染效率20%~30%，用400μg/ml G418进行筛选后约1周基本剔除未转染质粒的细胞（见图1~3）。

    3   讨      论

    许多研究发现在哺乳动物细胞中RNAi可以介导序列特异性的转录后基因沉默，其产生的siRNA与细胞内核酶复合物形成RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）, 经活化的RISC结合同源的mRNA序列(靶mRNA), 进而对靶mRNA切割，使靶mRNA降解, 从而达到抑制基因表达的目的。与传统的反义核酸技术相比, RNAi抑制靶基因的效率和特异性更高[3，4]。因此应用RNAi 技术阻断特定靶基因的表达用于肿瘤的已经成为新的热点[5]。

    有研究证实凋亡抑制机制是肿瘤细胞的普遍特性[6]，它能提高肿瘤细胞的生存能力，并且躲避机体的免疫监护系统及细胞毒素作用。凋亡抑制蛋白家族成员livin通过结合caspase3/7/9发挥抗凋亡作用，Zhang等[7]发现阻断livin的表达可促进白血病细胞凋亡及增强化疗药物的抗癌作用，因此应用RNAi技术研究livin对肿瘤耐药的影响很有意义。

    目前实现RNAi主要有6种方法，即化学合成、质粒载体介导的体内转录、病毒载体介导的体内转录、长双链RNA消化、PCR表达框介导的体内转录和体外酶法合成。本研究使用的质粒载体pGCsi-H1/Neo/GFP以新霉素抗性基因作为筛选标记并具有绿色荧光蛋白标记监测转染效率，通过在人源H1 启动子下游插入合成的siRNA转录模板，宿主细胞即可转录出带有茎环结构的shRNA，茎环结构序列可使转录出RNA链自我折叠成具发卡结构的小RNA分子，这些小RNA有19对互补碱基，3’端各有2个U突出，可引发靶基因的沉默，转染效率有很大的提高，具有干扰效率高、时间长等优点，通过G418筛选可构建稳定表达靶基因shRNA的细胞株。

    本研究成功构建了针对凋亡蛋白抑制因子livin基因的siRNA真核表达载体并转染入耐长春新碱的结肠癌细胞株HCT-8/V，为进一步研究抑制livin表达对肿瘤细胞耐药性状的影响奠定了基础，并对肿瘤耐药的治疗研究提供了新的方向。

【】
  [1] Vucic D, Stennicke HR, Pisabarro MT, et al. ML-IAP, a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas[J].Curr Biol,2000,10(6):1361-1364.

[2] Czauderna F, Fechtner M, Dames S, et al. Structural variations and stabilizing modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells[J].Nucleic Acids Res,2003,31(11):2705-2708.

[3] Tuschl T. Expanding small RNA interference[J].Nat Biote-chnol, 2002,20(2):446-448.

[4] Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschel T. RNA interference is mediated by 21 and 22 nucleotide RNAs[J]. Genes Dev,2001,15(2):188-192.

[5] Leung RK, Whittaker PA. RNA interference: from gene silencing to gene-specific therapeutics[J]. Pharmacology & Therapeutics,2005,107(5):222-225.

[6] Igney FH, Krammer PH. Death and anti-death: Tumor resistance to apoptosis[J]. Nature Reviews Cancer,2002,2:285-287.

[7] Qiuping Z, Jei X, Youxin J, et al. CC chemokine ligand 25 enhances resistance to apoptosis in CD4+ T cells from patients with T-cell lineage acute and chronic lymphocytic leukemia by means of livin activation[J].Cancer Research,2004,64(20):7579-7587.