改变组织醛固酮及其受体表达对SHR大鼠肾脏纤维化的影响

                     作者：成彩联， 娄探奇， 汤 颖， 石成钢， 陈珠江  

【摘要】  【目的】观察改变肾组织醛固酮及其受体水平对自发性高血压大鼠肾脏纤维化的影响。【方法】8周龄的雄性自发性高血压大鼠（SHR） 24只及同源正常京都大鼠（WKY） 8只，SHR分为贝那普利干预组［30 mg/(kg·d)］、大剂量安体舒通干预组［100 mg/(kg·d)］和高血压模型对照组，同时设同源的正常对照组，干预时间为8周，检测收缩压、尿蛋白、血白蛋白、尿素氮、肌酐、肾组织醛固酮受体、TGF-β1的mRNA和蛋白表达。【结果】贝那普利能下调组织醛固酮[（15.8±2.6）vs(22.2±0.6）pg/mg]及其受体水平[(15±4)vs(13±5)PU]并减轻肾脏纤维化［(17.0±1.8)vs(20.0±2.3)PU］，均为P< 0.05；大剂量安体舒通能上调组织醛固酮［（24.3±4.6）vs(22.2±0.6）pg/mg］及其受体水平［(16±6)vs(13±5) PU］并加重肾脏纤维化［(22.6±3.0)vs(20.0±2.3)PU］，均为P< 0.05。【结论】肾组织醛固酮及其受体水平的改变可能影响高血压肾脏纤维化的过程。

【关键词】  醛固酮； 醛固酮受体； 调节； 高血压； 肾脏纤维化

高血压主要通过促进动脉硬化形成导致的肾组织缺血性病变及通过肾小球高压力、高灌注、高滤过导致肾脏病变。醛固酮作为肾脏纤维化进程中的一个重要因素，已成为肾脏纤维化研究中的热点之一。醛固酮受体在器官纤维化中的作用也开始受到重视[1]，并有学者尝试改变靶器官中醛固酮受体的表达来影响器官纤维化的进程[2]。但醛固酮受体在器官纤维化中作用的研究多集中在心脏方面，在肾脏领域研究很少。本研究旨在研究改变醛固酮受体表达对肾脏纤维化的影响。

    1   材料与方法

    1.1   实验对象及分组

    24只8周龄的雄性自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats, SHR），质量200～250 g，购自上海市高血压研究所。SHR分为大剂量安体舒通干预组[100 mg/（kg·d）]；贝那普利干预组[30 mg/（kg·d）]（将药物溶于4 ml饮用水中灌胃）；高血压模型组；同时设同源的正常对照组京都大鼠（WKY）8只，高血压对照组及正常对照组予4 mL饮用水灌胃，干预时间为8周。

    1.2   观察指标及检测方法

    1.2.1   收缩压   大鼠的收缩压采用RBP-1B型大鼠血压计进行测量。

    1.2.2   尿蛋白和血生化（白蛋白、尿素氮、肌酐） 

    采用OLYPUS AU640全自动生化分析仪检测。

    1.2.3   血浆和组织醛固酮含量测定   ① 取血2 mL，加入肝素20 ?滋L抗凝，3000 r/min离心10 min（r＝20 cm），取上清测血浆醛固酮含量（pg/mL）；②取待测肾组织称重后加入0.5 mol/L的乙酸，100 ℃水浴15 min，冷却后匀浆，12000 r/min离心15 min，取上清液检测组织醛固酮含量（pg/mg）。测试盒由北京北方免疫试剂研究所提供，按试剂说明书操作。

    1.2.4   肾小管间质损伤评分   切片进行HE染色，参照[3]进行评分，200倍光镜下，每张切片随机选择10个不含肾小球的视野。肾小管间质病变由3个参数判定（小管扩张和蛋白管型；炎症细胞浸润；间质纤维化）每个参数按0～3分评定（0＝正常，1＝轻度受损，2＝中度受损，3＝重度受损）。每个样本小管间质的评分为0～9分。

    1.2.5   肾小球内胶原沉积   切片进行MASSON染色，参照文献[4]进行评分，200倍光镜下，每张切片随机选择肾组织内5个肾小球，利用图像分析系统，首先检测肾小球总面积，再检测相应肾小球内胶原的总OD(光密度)值（蓝色代表胶原纤维），胶原纤维OD/肾小球总面积，代表胶原纤维的含量。

    1.2.6   肾组织转化生长因子和醛固酮受体mRNA  采用RT-PCR方法，TRIZOL试剂购于Invitrogen Life Technologies公司，逆转录试剂盒购自晶美生物公司，PCR反应预混液购自宝生物工程（大连）有限公司。取总量为4 ?滋g的总RNA，以Random Primer为引物合成cDNA第一链，以cDNA为模板进行PCR反应。PCR扩增条件：GAPDH（725 bp）：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min，32个循环；TGF-β1（432 bp）：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min，32个循环；MR（486 bp）：94 ℃ 2 min，94 ℃ 1 min，49 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，35个循环。PCR产物经溴化乙锭染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳，全自动凝胶成像和化学发光分析系统扫描照相，分析电泳带的灰度，以与内参照GAPDH的条带密度A值之比半定量表达水平。

    1.2.7   肾组织TGFβ1和醛固酮受体蛋白   采用免疫组化方法，兔抗大鼠TGF-β1单克隆抗体（使用浓度为1 ∶ 100）购自Santa Cruz公司，抗兔SABC免疫组化试剂盒购自北京中山生物有限公司，山羊抗大鼠醛固酮受体多克隆抗体（使用浓度为1 ∶ 50）及抗山羊SABC免疫组化试剂盒均购自Santa Cruz公司。用德国 KONTRON IBAS 2.5全自动图象分析系统进行免疫组化结果定量分析[5]。

    1.3   统计方法

    数据以均数±标准差表示，统计软件采用SPSS11.0，根据方差齐性检验结果，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，方差不齐资料采用Games-Howell法进行两两比较，等级资料采用秩变换分析方法进行比较，α=0.05。

    2   结   果

    2.1   血浆及组织醛固酮水平、醛固酮受体mRNA和蛋白的表达情况

    高血压对照组大鼠肾脏的醛固酮及其受体均高于正常对照组（P< 0.05），贝那普利干预后，肾脏的醛固酮及其受体较高血压对照组明显降低(P< 0.05)；而大剂量安体舒通干预后，肾脏的醛固酮及其受体较高血压对照组明显升高(P< 0.05)，见图1、图2和表1。

    2.3   临床指标

    高血压对照组大鼠自实验开始时（8周龄）已出现高血压，此后，随着周龄增大，血压逐渐升高，在观察时间为8周（16周龄）时血压已升至180 mmHg左右，出现明显的蛋白尿和低白蛋白血症(P< 0.05)，血尿素氮和肌酐水平与正常对照组无明显区别(P >0.05)，正常对照组大鼠整个观察时间内都没有出现高血压。贝那普利干预后，血压逐渐下降，尿蛋白明显降低（P< 0.05），血白蛋白水平升高（P< 0.05）；大剂量安体舒通干预后，血压没有明显改变(P >0.05)，尿蛋白升高（P< 0.05），血白蛋白减少（P< 0.05）；血尿素氮和肌酐水平在各组间无明显区别（P >0.05），见表2。

    2.4   病理指标

    与正常对照组相比，高血压对照组可以看到蛋白管型，小管扩张，管周炎症细胞浸润，肾小球内胶原形成增多（P< 0.05）；贝那普利干预后，肾小球内胶原形成明显减少（P< 0.05）；安体舒通干预后，胶原形成明显增多（P< 0.05），见图3和表3。

    2.5   肾组织TGF-β1mRNA和蛋白的表达

    高血压对照组肾组织TGF-β1mRNA和蛋白的表达比正常对照组高（P< 0.05），贝那普利干预后，肾组织TGF-β1mRNA和蛋白的表达较高血压对照组明显降低（P< 0.05）；大剂量安体舒通干预后，肾组织TGF-β1mRNA和蛋白的表达明显升高，与高血压对照组比较有统计学差异（P< 0.05），见图4、图5和表3。

    3   讨   论

    肾素－血管紧张素－醛固酮系统对体内体液平衡和血压调节起着主要作用，醛固酮是有丝分裂和胶原合成的强烈刺激剂，可以促进心肌和肾脏纤维化[6]。醛固酮受体作为其中的一个重要环节，可能在肾脏纤维化的发生中起一定的作用。

    本实验结果发现，SHR组大鼠血压升高，尿蛋白明显增多，白蛋白明显下降，肾小球内胶原沉积增多，血管周围炎症细胞浸润、小管扩张、蛋白管型、肾脏损伤明显，肾脏的TGFβ1mRNA和蛋白表达也比正常对照组高，提示高血压可导致肾损伤和肾脏纤维化。本实验同时观察到SHR组大鼠血浆和组织的醛固酮水平及肾组织的醛固酮受体mRNA和蛋白表达均明显高于正常对照组。Delano等[7]亦观察到自发性高血压大鼠肠系膜毛细血管上醛固酮受体的密度高于正常对照组，导致对醛固酮的反应升高的报道相符。由此我们设想，肾组织醛固酮及其受体的水平升高可能参与了肾损害的过程，改变肾脏醛固酮及其受体水平可能对肾脏纤维化有所影响。本实验发现予贝那普利下调肾脏的醛固酮及其受体表达后，蛋白尿明显减少，血白蛋白明显增高；肾小球内的胶原形成明显减少，肾小管的扩张减轻，小管上皮细胞基本恢复正常，基本看不到蛋白管型，血管周围炎症细胞浸润减轻，与Beggah等[2]用反义RNA链减少醛固酮受体表达后心脏纤维化减轻的现象相似。同时予大剂量安体舒通上调肾脏醛固酮及其受体的水平后，尿蛋白明显增加，血白蛋白水平下降，间质炎症细胞浸润加重，血管壁增厚、玻璃样变、血管腔缩小甚至闭塞、肾小管萎缩、蛋白管型、肾小球内胶原形成增多等病变，有部分肾小球硬化，肾间质的TGFβ1mRNA和蛋白表达增高，与Yoshida [1]报道的舒张性心力衰竭心肌组织中醛固酮受体的表达增高促进心肌纤维化的发展有相似之处，尽管观察的靶器官不同。以上结果提示，改变组织醛固酮及其受体水平可能影响肾脏纤维化的进程，但尚需进一步研究证实。

    虽然有其他措施可以下调肾脏醛固酮受体的表达，如环孢霉素A（CsA）等，但这些措施在临床实际应用中并不可行，或存在其它对机体不利的因素。目前国内外尚未见到ACEI下调肾脏醛固酮受体的相关报道，De Resende等[8]研究发现卡托普利可以使梗死的心肌组织中升高的醛固酮受体表达恢复正常，但对肾组织正常表达的醛固酮受体没有影响。我们观察到的结果不同可能与所使用的动物模型不同有关。本研究的发现为ACEI肾脏纤维化提供了新的依据，同时也提示这可能是ACE治疗肾脏纤维化的部分机制。

    大剂量安体舒通上调肾脏醛固酮受体的表达后，肾组织中升高的醛固酮受体不但因结合了大量的安体舒通表现出激动效应[9]，而且还有部分醛固酮受体可结合醛固酮，两种效应相加，加重了肾脏纤维化。目前关于大剂量安体舒通上调醛固酮受体仅在大脑有报道[10]。国内外虽然也有个别关于大剂量安体舒通导致肾脏纤维化加重的报道[12]，但未见上调肾脏醛固酮受体的报道。本研究结果提示大剂量安体舒通可能加重肾脏纤维化，为临床正确掌握使用安体舒通的剂量提供了一定的意见。

    本研究结果提示，醛固酮及其受体的表达水平与高血压致肾脏纤维化可能有关，改变其表达水平可能影响肾脏纤维化的进程。

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