乳腺癌病人血清HER-2/neu检测及其临床意义
作者：朱美琴， 滕小玉， 姜文奇， 刘冬耕， 张东生， 周宁宁
【摘要】 【目的】 本研究分析晚期乳腺癌患者血清HER-2/neu的水平与预后的关系，并探讨其临床意义。【方法】 酶联免疫法（ELISA）检测94例晚期乳腺癌患者血清HER-2/neu的浓度，分析血清与组织中HER-2/neu表达的相关性，并分析其与患者预后的关系。【结果】 94例晚期乳腺癌患者就诊时的血清HER-2/neu浓度为0.34～275.25 ?滋g/L（平均浓度为23.69 ?滋g/L）。血清HER-2/neu浓度的高低与化疗的有效性、疾病进展时间的长短无关。晚期乳腺癌患者的血清HER-2/neu浓度与肿瘤组织中HER-2/neu表达强阳性是一致的。【结论】 血清HER-2/neu尚不能确立为独立的预后指标，需要更多的病例进行分析。
【关键词】 乳腺肿瘤； 血清HER-2/neu； 酶联吸附法； 预后
Abstract:【Objective】 This study was to analyze the relationship between the serum HER-2/neu protein levels and prognosis in advanced breast cancer patients. 【Methods】 The serum HER-2/neu protein levels of 94 advanced breast cancer patients were detected using ELISA method. The relationship between the protein level and patient prognosis were analyzed retrospectively. Besides, the consistency of expression in serum and tissue was also analyzed. 【Results】 The concentrations of serum HER-2/neu were 0.34 μg/L to 275.25 μg/L (mean 23.69 μg/L). HERe was no correlation between serum HER-2/neu levels and time to progress (TTP). In addition, the level of serum HER-2/neu was concordance with strong expression of HER-2/neu in tumor tissue in advanced breast cancer. 【Conclusion】The clinical utility of serum HER-2/neu as a prognostic indicator has not yet been established and needs more cases to evaluate.
Key words: breast neoplasm; serum HER-2/neu; enzyme-linked immunosorbnent assay（ELISA）; prognosis
［J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28（6）:678-682］
乳腺癌已成为女性最常见的恶性肿瘤，也是常见的女性肿瘤死亡原因[1]。大约有20％～30％的乳腺癌患者HER-2/neu高表达, HER-2/neu高表达与患者的不良预后密切相关[2]。HER-2/neu基因是人表皮生长因子家族的第2位成员。定位于染色体17q21，其编码一种分子量为185 ku的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，结构上分为膜外配体结合域、跨膜区和膜内酪氨酸激酶的活性域[3]。HER-2/neu蛋白的胞外部分可以从细胞的表面脱落至血液中，形成分子量大约为105 ku的可溶性蛋白HER-2ECD。这种可溶性蛋白可以用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）测定[4]。我们用ELISA法检测了于2003年3月至2006年4月在中山大学肿瘤防治中心内科住院的初治复发乳腺癌患者共94例，比较了晚期乳腺癌患者肿瘤组织和血清HER-2/neu水平的相关性，研究了血清HER-2/neu水平对晚期乳腺癌患者化疗近期疗效和远期生存的预测价值。
1 材料与方法
1.1 研究对象
收集2003年3月至2006年4月在中山大学肿瘤防治中心内科住院经组织病理确诊的初治复发乳腺癌患者共94例，患者的临床特征详见表1。
采集前患者的全静脉血2 mL，共94份，置于干燥无抗凝试管中，静置15 min后3 000 r/min(r=10 cm)离心10 min，取血清置于EP管，于-20 ℃冰箱中保存备用。
1.2 实验主要试剂与设备
1.2.1 主要试剂 96孔可溶性人SP-185 ELISA定量检测商品试剂盒，购自深圳晶美生物公司（原装Bender Medsystems产品）。
1.2.2 实验步骤 首先采集患者静脉血2 mL，离心后分离上层血清，－20 ℃冰箱保存备用。将实验血清标本由－20 ℃冰箱中取出，室温让其解冻融化，摇匀所有的检测试剂。1 ∶ 20稀释血清标本得检测样品（1 ∶ 20是推荐稀释比例，预实验得出此稀释比例合理）。用冲洗缓冲液清洗孔板2次，倾去缓冲液，立即将平板反盖于吸水纸上，吸去游离水分。加100 μL检测缓冲液于双孔至所有的标准孔板中，空余第一个孔板（10 μg/L）。准备标准稀释液，移取200 μL SP185-HER-2标准液至孔A1、A2，双孔。移取100 μL至孔B1、B2，分别混合B1、B2中的物质，并将100 μL移至C1、C2。此步骤重复4次，制造出2组SP185稀释液，从10～0.16 μg/L。从最后一个孔板中，丢弃100 μL液体（G1、G2）。加100 μL检测缓冲液至空白孔中，双孔。加100 μL的1 ∶ 20稀释待测样品至指定的孔中，双孔。加50 μL稀释的HRP-亲和素至所有的孔板中，包括空白板。盖上塑料遮盖皮，放于旋转器上以100 r/min速度旋转，在室温中孵育2 h。移走塑料遮盖皮，倾去平板中的液体，用冲洗缓冲液冲洗平板3次，倾去缓冲液，立即将平板反盖于吸水纸上，吸去游离水分。移取100 μL混合的TMB底物溶液到所有的孔中，放于旋转器上以100 r/min速度旋转，避光在室温中孵育10 min。向每孔加入100 μL的终止溶液终止反应，并立即用450 nm波长读取每孔吸光度（A值）。
以每孔读取的吸光光度值减去空白孔阴性对照平均吸光度值为每孔A值，再以每个样品复孔的平均A值为每个样品的A值。根据标准品浓度与吸光度绘出标准曲线，再根据标准曲线得出每个检测样品的浓度，每个检测样品乘以稀释比例20即为待测标本的浓度。
1.2.3 结果判定 血清SP-185 ELISA定量检测商品试剂盒反应结束后，经分光光度仪扫描，读数高于15者为阳性，低于15者为阴性（根据试剂盒说明）。
1.3 病例随访和疗效评价标准
在病案室随访每个病例的病历，记录其年龄、性别、治疗方案、绝经情况、病理类型、激素受体情况、转移器官数目、有无内脏侵犯、中位生存期（从发现转移至死亡时间）、生存率及中位无疾病进展时间（发现转移后进行治疗至疾病进展时间）等。所有患者在治疗前均有CT或B超检查等记录评价病灶，均有可评价病灶，血常规、肝肾功能和心电图检查均正常。疗效的评价按照WHO（1981年）制定的实体瘤客观疗效评定标准。
1.4 统计学方法
用SPSS 10.0统计软件包进行统计学分析，相关性分析采用X2检验，生存分析采用寿命表法、单因素Kaplan-Meier法。以P＜ 0.05定义为有统计学意义。
2 结 果
2.1 血清HER-2/neu浓度与肿瘤组织中HER-2/neu表达的关系
94例晚期乳腺癌患者就诊时的血清HER-2/neu浓度为0.34～275.25 μg/L（平均浓度为23.69 μg/L），以15 μg/L为标准，将94例予姑息化疗的晚期乳腺癌患者划分为两组，其中22例患者血清HER-2/neu浓度＞15 μg/L，占所有病例的23.4%，72例血清HER-2/neu浓度≤15 μg/L，占所有病例的76.6%。以免疫组化中+++ 代表阳性，其余为阴性，分析血清HER-2/neu浓度与组织中表达的关系。本研究结果显示，晚期乳腺癌患者的血清HER-2/neu浓度与肿瘤组织中HER-2/neu表达是一致的(表2)。
2.2 生存情况
全组94例晚期乳腺癌患者均获全程随访，中位随访期18.5个月（5～46个月）。全组截止随访时间为2007年3月。全组生存64例，死亡30例，均死于肿瘤进展。中位无疾病进展时间为8个月（0～32个月），中位生存期18.5个月（5～46个月）。预计1、2年生存率分别为81.9％、64.1％(图1)。
以就诊时血清HER-2/neu是否 ＞15 μg/L分为两组，用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，就诊时血清HER-2/neu ＞15 μg/L组的中位生存期17.5个月，预计1年和2年生存率分别为77.3%和51.5%；就诊时血清HER-2/neu≤15 μg/L组中位生存期19个月，预计1年和2年生存率分别为83.3％和67.7％。经log-rank检验分析，前血清HER-2/neu升高组的1年和2年生存率和HER-2/neu正常组无明显差异（χ2=0.84, P=0.359）。两组的生存曲线见图2。
以就诊时血清HER-2/neu是否 ＞15 μg/L分为两组，用Kaplan-Meier法绘制TTP（治疗至疾病进展时间）曲线，就诊时血清HER-2/neu ＞15 μg/L组的中位TTP6个月（0～29个月），血清HER-2/neu≤15 μg/L组中位TTP8个月（0～32个月）。血清HER-2/neu≤15 μg/L组中位TTP高于HER-2/neu＞15 ng/mL组，但统计学上无差异（χ2=1.87, P=0.1714）。两组的TTP曲线见图3。
HER-2/neu基因是人表皮生长因子家族的第2位成员，定位于染色体17q21，包括信号肽、胞外区、胞浆区和跨膜区。HER-2/neu的表达水平与肿瘤的发生、及预后有密切的关系[2]。HER-2/neu基因的过度扩增或HER-2/neu蛋白产物的过度表达与乳腺癌不良的预后相关。而随着目前在晚期转移性乳腺癌患者中对单克隆抗体Herceptin的使用，更需要精确地检测乳腺癌患者HER-2/neu的表达情况，以使更好地选择适合的治疗方法。
目前在临床上，通常使用免疫组化法检测HER-2/neu的蛋白表达，或是原位荧光杂交法检测HER-2/neu基因的扩增。但这两种方法都存在判断方法不够标准，与检测者的主观判断有关[5]。而HER-2/neu的胞外段可用ELISA法在循环血清中测量，并且它在晚期转移性乳腺癌患者可能是升高的[6]。血清HER-2/neu胞外段可能可以作为乳腺癌患者治疗的一个重要的依据，美国FDA已经批准血清HER-2/neu胞外段可以用于晚期转移性乳腺癌不同治疗方法的疗效监测[7]。
有研究表明，正常人群血清中存在由细胞表面脱落的ECD片段，但水平较低；而在晚期转移性乳腺癌患者中，有30％～50％患者的高于正常水平[8]。而在本实验中，94例晚期乳腺癌患者中22例患者血清HER-2/neu浓度 ＞15 ug/L，占所有病例的23.4%，处于Krainer等[9]报道的15％～30％之间，与Molina等[10]报道的28.4％也是接近的。在本研究中，我们用ELISA法检测患者血清中C-erbB2胞外段的浓度水平和IHC法检测乳腺癌患者肿瘤组织中HER-2/neu蛋白表达是一致的，也就是说，乳腺癌患者肿瘤组织中HER-2/neu高表达者（+++），其血清HER-2/neu胞外段的浓度可能也升高。这点和Fornier等[11]的研究也是一致的。
在本实验中，我们并没有发现血清HER-2/neu浓度的高低与TTP的长短相关，这个结论跟之前某些学者的看法是不一致的，可能与选择的研究群体不同有关[12，13]。在我们的研究中，我们是同时选用了HER-2/neu阳性及HER-2/neu阴性的患者作为研究对象，但其他学者仅选择了HER-2/neu过度表达的晚期转移性乳腺癌患者来研究[12，13]。此外，本研究中，我们检测到血清HER-2/neu的平均浓度为23.69 ?滋g/L，Koestler等[13]和Esteva等[12]报道的平均浓度分别为45.1和41.9 ?滋g/L。我们分析了肿瘤组织中HER-2/neu的表达对乳腺癌患者TTP的影响，结果仍无统计学意义。这一点与既往的研究[14]是不一致的。因而，本实验中血清HER-2/neu浓度对TTP无影响亦有可能是病例选择的原因，需要进一步的研究。
综上所述，本研究通过对94例晚期转移性乳腺癌患者血清HER-2/neu浓度的测定和肿瘤组织中HER-2/neu表达情况的检测，发现两者之间有较好的一致性。但本试验得结果不支持以血清HER-2/neu浓度作为晚期转移性乳腺癌患者独立的预后指标。因此仍需加大样本量进一步的研究。:
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