17β-雌二醇的快速舒血管效应及其内皮依赖和非内皮依赖的机制
作者：王庭槐， 杨艳芳， 付晓东， 谈 智， 向秋玲， 林桂平
【摘要】 【目的】 本实验旨在观察17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)的快速舒血管效应并探讨其内皮依赖和非内皮依赖的作用机制。【方法】 采用Myodap and Myodata血管张力仪进行体外血管灌流实验，测量鼠离体胸主动脉环等长张力。【结果】 E2能浓度依赖性地快速舒张血管，浓度为10－9～10－6 mol/L时，去内皮的血管环舒张程度明显小于内皮完整的血管环，而当E2浓度增加至10－5 mol/L时，去内皮的血管环与内皮完整的血管环舒张程度无差异；在内皮完整的血管环，分别用左旋硝精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME）、亚甲蓝（methylene blue, MB）、他莫昔芬（tamoxifen）、甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin, MβCD）预孵育均能显著抑制E2（10－6 mol/L）的舒血管效应；而在去内皮的血管环，E2（10－5 mol/L）能抑制CaCl2在无钙高钾溶液中诱发的血管收缩。【结论】 E2的快速舒血管效应，具有内皮依赖性，与雌激素受体介导内皮释放一氧化氮（nitric oxide, NO）有关，且质膜微囊结构必须完整，而当E2浓度较高时主要是通过抑制细胞外的钙内流直接舒张血管，为非内皮依赖性。
【关键词】 17β-雌二醇； 血管舒张； 内皮； 质膜微囊
1 材料和方法
1.1 离体血管环的制备和张力测定
雌性SD大鼠（150～250 g），由中山大学中山医学院实验动物中心提供。SD大鼠断颈处死，迅速分离胸主动脉，放入预冷的Krebs液，去除血管上的脂肪及结缔组织，将动脉剪成2段长2 mm的血管环，置于10 mL含Krebs液的器官小室中。两根细金属丝分别由血管内腔穿过血管环，并固定于Myodap and Myodata血管张力仪（丹麦，Danish Myo Technology A/S）两端的肌动描记器装置上，将温度设定在37 ℃，持续充以95％ O2和5％ CO2的混合气体。调整血管环至适当的前负荷 (通过血管张力仪标准化步骤确定)，平衡60－90 min，期间每隔20 min更换 Krebs液一次。实验血管先用苯肾上腺素（PE ，10－6 mol/L）鉴别血管收缩活性，一些实验血管需去除内皮，采用不绣钢丝插入血管腔中轻轻滚动完成，用ACh（10－5 mol/L）检测内皮完整性，对ACh舒张大于70％认为内皮完整，舒张消失则认为内皮破坏成功。冲洗血管环再次平衡至基线水平，然后进行实验[4]。
1.2 显微镜
内膜完整的主动脉血管环分别用Krebs（对照）或6 mmol/L甲基-β-环糊精处理60 min，4 ℃固定过夜放在含2%戊二醛和2%多聚甲醛和蔗糖的0.1 mol/L的二甲砷酸钠盐溶液中，样本用0.1 mol/L的二甲砷酸钠盐溶液冲洗，然后再次固定于4％锇酸中1 h，样本用乙醇脱水、用环氧树脂包埋在Epon812，超薄切片用醇制的醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色，用JEOL-1010透射电子显微镜观察内膜结构。
1.3 试剂和溶液
17β-雌二醇（17-茁-estradiol, E2）、苯肾上腺素（phenylephrine, PE）、乙酰胆碱（achtylcholine, ACh）、他莫昔芬（tamoxifen）、左旋硝精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME）、亚甲蓝（methylene blue, MB）、甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin, MβCD），KCl均为美国Sigma公司产品，其他试剂为国产分析纯。E2用无水乙醇溶解后用超纯水配制；他莫昔芬用DMSO配制成10－2 mol/L的原液，实验时加入Krebs液，工作浓度为10－5 mol/L，药物剂量均以浴槽中的终浓度表示。本实验加到浴槽中的无水乙醇或DMSO终浓度最大为0.1％(v/v)，并不影响血管张力。Krebs液组成（mmol/L）：NaCl 119，KCl 4.7，NaHCO3 25，MgCl2 1，KH2PO4 1.2，Glu 11 ，CaCl2 2.5。无钙 Krebs液：CaCl2用1 mmol/L EGTA替换。在高钾去极化液中，NaCl液用相应摩尔的KCl替代。
1.4 统计分析
所有数据均以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，收缩剂诱发的最大稳定收缩幅度定为标准值100％，血管舒张的幅度以占标准值的百分比来表示。SPSS12.0统计分析软件进行组间t检验，P< 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 E2对预收缩血管的效应及去除内皮的影响
内皮完整或去内皮的血管环，用PE（10－6 mol/L）或高钾(100 mmol/L)预收缩，稳定后分别加入不同浓度E2（10－9－10－5 mol/L），结果显示，E2呈浓度依赖性地舒张血管，约5 min起效，30 min达到平衡。E2浓度为10－9－10－6 mol/L时，去内皮的血管环舒张程度明显小于内皮完整的血管环；但在E2浓度增高至10－5 mol/L时，去内皮与内皮完整的血管环血管舒张程度无差异［内皮完整：（67.18±9.58）％，去内皮：（57.99±12.57）％; n=10; P >0.05；图1］。
2.2 L-NAME和MB对E2舒血管作用的影响
L-NAME是一氧化氮合酶NOS的抑制剂，MB是鸟甘酸环化酶GC的抑制剂。内皮完整的血管环用L-NAME（10－4 mol/L）或MB（10－5 mol/L）孵育20 min，然后用PE或高钾预收缩，稳定后加入E2（10－6 mol/L）。结果表明，L-NAME或MB可以显著抑制E2的舒血管效应（图2-4）；去内皮与内皮完整用L-NAME或MB孵育的血管环舒张没有统计学差异（n=11， P >0.05）。
2.3 雌激素受体在E2舒张血管中的作用
为了观察雌激素受体是否参与介导了雌激素的快速舒血管效应，内皮完整的血管环，用选择性雌激素受体阻断剂他莫昔芬（10－5 mol/L）孵育30 min，用PE预收缩，加入E2（10－6 mol/L），与对照组不用他莫昔芬孵育比，观察到E2舒血管效应显著抑制（图3）。
2.4 甲基-β-环糊精对质膜微囊结构的影响
用透射电子显微镜观察甲基-β-环糊精（MβCD）对主动脉内膜质膜微囊结构的影响。与对照组用Krebs液孵育比较（图5A），内膜完整的血管环用MβCD处理（6 mmol/L，60 min）后，质膜微囊结构显著被破坏（图5B）。
2.5 甲基-β-环糊精对E2舒张血管效应的影响
内膜完整的血管环，用甲基-β-环糊精（MβCD，6 mmol/L）预处理60 min后，用高钾预收缩，稳定后加入不同浓度E2（10－8～10－6 mol/L）。结果表明，与对照组不用MβCD处理相比，E2诱导的血管舒张效应显著抑制（图6）。
2.6 E2对CaCl2收缩量效曲线的影响
为研究高浓度E2是否主要通过抑制细胞外钙内流而直接舒张血管平滑肌，在去内皮的血管环，测量E2对CaCl2在无钙高钾溶液中收缩的影响。去内皮的血管环，用无钙Krebs溶液冲洗3次（间隔10 min），稳定后，换用无钙高钾溶液（含1 mmol/LEGTA，60 mmol/L K+），无/有E2（10 -5 mol/L）孵育30 min，累积加入CaCl2（10–4、4×10–4、10–3、4×10–3、10-2 mol/L）。 结果显示，在无钙高钾溶液中，CaCl2诱导浓度依赖性血管收缩，E2（10-5 mol/L）孵育可抑制CaCl2诱导的血管收缩，使CaCl2收缩量效曲线右移（图7）。
3 讨 论
关于雌激素快速舒张血管作用的机制还存在着争议，以往报道有血管内皮依赖性和非内皮依赖性两种途径[5]，但其具体作用机制并不十分明确。本实验以SD大鼠离体胸主动脉环为研究对象，研究发现，雌激素以何种途径舒张血管，与雌激素作用的浓度有关，本实验中，E2浓度为10－9～10－6 mol/L时作用呈内皮依赖性，与雌激素受体介导内皮释放NO有关，且需要内膜质膜微囊结构完整；而E2浓度增高至10－5 mol/L时作用呈非内皮依赖性，主要通过抑制细胞外的钙内流而直接舒张血管平滑肌。Salom等[2]研究表明E2的快速血管舒张效应是非内皮依赖性的，其实验采用浓度为10－5～10－4 mol/L；而Ma等[5]采用E2浓度为10－9～10－6 mol/L，发现其快速舒血管效应是依赖内皮的。由此推测以往报道的雌激素快速舒张血管存在依赖内皮和非依赖内皮两种途径其实并不矛盾，可能与研究者实验采用雌激素作用浓度不同有关。
本实验观察到无论是内皮完整或是去内皮的血管环，用PE或高钾预收缩，E2能剂量依赖性地快速舒张血管。在E2浓度为10-9～10-6 mol/L时，去内皮的血管环舒张程度较内皮完整的血管环小；内皮完整的血管环，用一氧化氮合酶(NOS)的抑制剂L-NAME（10-4 mol/L，20 min）孵育可显著抑制E2的舒血管作用，使内皮完整与去内皮血管环的舒张差异消失。以上提示10-9～10-6 mol/L浓度E2的舒张血管效应是部分依赖内皮释放NO的。众所周知，血管壁上NO由内皮型一氧化氮合酶（eNOS）催化L-精氨酸和分子氧产生，能快速扩散至血管平滑肌，激活GC，增加细胞内cGMP，cGMP激活cGMP-依赖的蛋白激酶PKG，导致血管平滑肌舒张。本实验也发现，加入GC抑制剂亚甲蓝（MB）后，E2的舒血管效应同样被抑制，进一步表明NO-GC-cGMP信号通路参与了雌激素的快速舒张血管效应。
在内皮完整的血管环，选择性雌激素受体阻断剂他莫昔芬可以完全抑制E2的快速舒血管作用，提示雌激素受体参与介导了雌激素的快速舒血管作用。雌激素的舒张血管作用发生迅速，是一种非基因效应，提示细胞膜上有雌激素受体表达[6]。
质膜微囊是细胞膜上直径约50～100 ｎｍ,呈烧瓶状或希腊字母Ω状的特异性内陷囊状结构，在内皮细胞表达丰富[7]。胆固醇对于维持质膜微囊的正常结构和功能非常重要[8]。甲基-β-环糊精（MβCD），水溶性的环状低聚糖，不可透过细胞膜，其疏水核心能够接收一分子的胆固醇，通过溶解质膜胆固醇而减少细胞胆固醇含量，已作为一种药研究工具有效地用于研究质膜微囊在血管反应性中的作用[9]。本实验用透射电镜观察到，内皮完整的主动脉血管环用MβCD处理（6 mmol/L，60 min）后，质膜微囊结构明显被破坏。此外，内皮完整的血管环，用MβCD（6 mmol/L，60 min）处理后，E2诱导的舒血管效应也被显著抑制，表明质膜微囊结构的完整对雌激素的快速舒血管作用是必须的，与本实验结论一致的是，Stirone等采用MβCD（5 mmol/L，30 min）对离体兔大脑动脉血管预处理，观察到E2快速释放NO的产量显著被抑制。该研究还发现膜雌激素受体（ERα）位于质膜微囊结构，与微囊蛋白-1存在密切关系，因此破坏质膜微囊结构，膜雌激素受体介导的NO释放也显著减少[10]。
本实验显示在E2浓度为10-5 mol/L时，去内皮的血管环和内皮完整的血管环舒张程度无差异，即内皮的有无并不影响E2的舒血管效应，提示E2也有不依赖血管内皮而直接舒张血管平滑肌的作用。血管平滑肌细胞膜上主要有两种钙通道，即受体操作性钙通道(ROCC)和电压依赖性钙通道(VDCC)，对血管舒缩活动起重要作用。PE是一种α肾上腺素受体激动剂，它通过开放ROCC而导致血管收缩，而当细胞外钾浓度增高时，可使血管平滑肌细胞膜电位去极化而激活VDCC，导致细胞外钙内流而引起血管收缩[11]。本实验中无论是用PE或是用高钾预收缩的血管，E2均使之舒张，表明E2既对ROCC有抑制作用，也对VDCC有抑制作用。此外，CaCl2在无钙高钾溶液中引起的浓度依赖性血管收缩也主要依赖外钙内流。本实验中，去内皮的血管环，E2（10-5 mol/L）预处理能显著抑制在无钙高钾溶液中的CaCl2诱发的血管收缩效应，进一步表明雌激素可能作为钙拮抗剂抑制细胞外的钙离子内流而直接舒张血管。临床上存在一些雌激素水平非常高的情况，比如，体外受精时，卵巢高度敏感，体内雌激素水平非常高；女性在患有促性腺激素细胞瘤时，体内雌激素水平也显著高于正常状态。本实验为高浓度雌激素舒张血管机制提供了实验依据。
需要指出的是，体内生理水平雌激素水平约为纳摩尔数量级，本实验中能够舒张大鼠胸主动脉血管的最低有效浓度要高于体内生理水平的雌激素浓度或临床激素替代疗法的浓度，这可能因为体外实验不包括其他循环激素、体液因子（可能在体内与雌激素有协同作用）及血量等的影响。而且，动物物种及动物体内激素状况，血管种类也影响体外实验中离体血管对激素的反应[12]。本实验与Salom等进行的离体血管体外灌流实验一样，只是观察了雌激素在体外的快速非基因效应，而并未探讨雌激素在体内的长期效应和整体效应，这也是体外实验模型的局限性。
本实验表明，在雌性SD大鼠离体胸主动脉血管环，E2能呈浓度依赖性地快速舒张血管，既有内皮依赖性作用机制，也有非内皮依赖性作用机制，与E2作用浓度有关。浓度较低时，作用为内皮依赖性，与细胞膜上雌激素受体介导内皮释放NO有关，且需要质膜微囊结构完整，而当E2浓度增高时，主要通过抑制细胞外的钙内流直接舒张平滑肌血管，为非内皮依赖性。
【】
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本实验观察到无论是内皮完整或是去内皮的血管环，用PE或高钾预收缩，E2能剂量依赖性地快速舒张血管。在E2浓度为10-9～10-6 mol/L时，去内皮的血管环舒张程度较内皮完整的血管环小；内皮完整的血管环，用一氧化氮合酶(NOS)的抑制剂L-NAME（10-4 mol/L，20 min）孵育可显著抑制E2的舒血管作用，使内皮完整与去内皮血管环的舒张差异消失。以上提示10-9～10-6 mol/L浓度E2的舒张血管效应是部分依赖内皮释放NO的。众所周知，血管壁上NO由内皮型一氧化氮合酶（eNOS）催化L-精氨酸和分子氧产生，能快速扩散至血管平滑肌，激活GC，增加细胞内cGMP，cGMP激活cGMP-依赖的蛋白激酶PKG，导致血管平滑肌舒张。本实验也发现，加入GC抑制剂亚甲蓝（MB）后，E2的舒血管效应同样被抑制，进一步表明NO-GC-cGMP信号通路参与了雌激素的快速舒张血管效应。
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本实验显示在E2浓度为10-5 mol/L时，去内皮的血管环和内皮完整的血管环舒张程度无差异，即内皮的有无并不影响E2的舒血管效应，提示E2也有不依赖血管内皮而直接舒张血管平滑肌的作用。血管平滑肌细胞膜上主要有两种钙通道，即受体操作性钙通道(ROCC)和电压依赖性钙通道(VDCC)，对血管舒缩活动起重要作用。PE是一种α肾上腺素受体激动剂，它通过开放ROCC而导致血管收缩，而当细胞外钾浓度增高时，可使血管平滑肌细胞膜电位去极化而激活VDCC，导致细胞外钙内流而引起血管收缩[11]。本实验中无论是用PE或是用高钾预收缩的血管，E2均使之舒张，表明E2既对ROCC有抑制作用，也对VDCC有抑制作用。此外，CaCl2在无钙高钾溶液中引起的浓度依赖性血管收缩也主要依赖外钙内流。本实验中，去内皮的血管环，E2（10-5 mol/L）预处理能显著抑制在无钙高钾溶液中的CaCl2诱发的血管收缩效应，进一步表明雌激素可能作为钙拮抗剂抑制细胞外的钙离子内流而直接舒张血管。临床上存在一些雌激素水平非常高的情况，比如，体外受精时，卵巢高度敏感，体内雌激素水平非常高；女性在患有促性腺激素细胞瘤时，体内雌激素水平也显著高于正常状态。本实验为高浓度雌激素舒张血管机制提供了实验依据。
需要指出的是，体内生理水平雌激素水平约为纳摩尔数量级，本实验中能够舒张大鼠胸主动脉血管的最低有效浓度要高于体内生理水平的雌激素浓度或临床激素替代疗法的浓度，这可能因为体外实验不包括其他循环激素、体液因子（可能在体内与雌激素有协同作用）及血量等的影响。而且，动物物种及动物体内激素状况，血管种类也影响体外实验中离体血管对激素的反应[12]。本实验与Salom等进行的离体血管体外灌流实验一样，只是观察了雌激素在体外的快速非基因效应，而并未探讨雌激素在体内的长期效应和整体效应，这也是体外实验模型的局限性。
本实验表明，在雌性SD大鼠离体胸主动脉血管环，E2能呈浓度依赖性地快速舒张血管，既有内皮依赖性作用机制，也有非内皮依赖性作用机制，与E2作用浓度有关。浓度较低时，作用为内皮依赖性，与细胞膜上雌激素受体介导内皮释放NO有关，且需要质膜微囊结构完整，而当E2浓度增高时，主要通过抑制细胞外的钙内流直接舒张平滑肌血管，为非内皮依赖性。
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