IL-10在系统性红斑狼疮患者PBMC B细胞刺激因子表达中的作用

            作者：叶玉津， 梁柳琴， 许韩师， 杨岫岩， 詹钟平， 连 帆， 尹培达     

【摘要】  　　【目的】 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)B细胞刺激因子(Blys)基因和蛋白在体外的表达及IL-10对其表达的影响。【方法】 梯度密度离心法分离25例系统性红斑狼疮患者和20名女性健康志愿者外周血单个核细胞，分为2组, IL-10(100 ng/mL)组和培养基组(仅含RPMI1640培养基)，分别于培养0、6、12、24、72 h离心收集PBMCs，RT-PCR法检测刺激后0～24 h细胞Blys mRNA表达，流式细胞仪和直接免疫荧光法检测72 h膜结合型Blys蛋白表达。【结果】 ①系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞Blys mRNA和蛋白表达体外高于健康对照(P<0.001)。②IL-10显著增强健康对照和系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞Blys mRNA表达，12 h作用最强（0.487±0.058 vs 0.251±0.050，P< 0.001；0.638±0.084 vs 0.392±0.059，P< 0.001）。③IL-10显著增强健康对照和系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞膜结合型Blys蛋白表达(FACs, 4.53±0.71 vs 3.24±0.57，P< 0.001;5.79±0.91 vs 4.55±0.83，P< 0.001)。 ④直接免疫荧光法检测外周血单个核细胞膜结合型Blys蛋白显示，IL-10刺激后Blys表达增强。【结论】 IL-10可上调系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞 Blys基因和蛋白表达。

【关键词】  系统性红斑狼疮； B淋巴细胞刺激因子； IL-10； 外周血单个核细胞

    Abstract：【Objective】To determine the expression of membrane-bound B lymphocyte stimulator (Blys) protein and its mRNA in vitro of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from systemic lupus erythematosus (SLE) patients, and to investigate the role of interleukin-10 (IL-10) on the expression of Blys. 【Methods】PBMCs were obtained from 25 SLE patients and 20 healthy volunteers. They were randomized into IL-10 (100 ng/mL) group and media group. PBMCs were collected at 0, 6, 12, and 24 h for Blys mRNA assessment using semi-quantitative reverse transcription-PCR (RT-PCR). PBMCs were also collected at 72 h for membrane-bound Blys protein detection using flow cytometry and direct immunofluorescence. 【Results】 ①The expression of Blys mRNA and membrane-bound protein in PBMCs was significantly higher in SLE patients than healthy controls in vitro(P< 0.001). ②IL-10 enhanced Blys mRNA expression in PBMCs in both healthy controls and SLE patients, with the greatest effect at 12 h (0.487±0.058 vs 0.251±0.050，P< 0.001；0.638±0.084 vs 0.392±0.059，P< 0.001).③IL-10 also increased the expression of membrane-bound Blys protein in both healthy controls and SLE patients (FACs, mean fluorescence intensity, 4.53±0.71 vs 3.24±0.57，P< 0.001; 5.79±0.91 vs 4.55±0.83，P< 0.001).④Direct immunofluorescence by con-focus micrography also indicated that IL-10 increase the expression of membrane-bound Blys protein. 【Conclusion】 In vitro, the expression of Blys mRNA and membrane-bound protein was elevated in SLE patients, and IL-10 had positive effects on its expression.

    Key words：systemic lupus erythematosus； B lymphocyte stimulator； IL-10； peripheral blood mononuclear cells

是近年发现的一种与免疫相关的细胞因子，属TNF配体超家族新成员，对B细胞具有强的促增殖、分化和分泌抗体作用。研究显示，Blys转基因鼠可出现狼疮样症状[4]； 狼疮鼠模型(MRL/MP-Lpr/Lpr和NZB/WF1)中[5]，随时间延长及疾病进展，Blys水平进行性升高，且与狼疮鼠肾损害有关，用可溶性Blys受体可显著延长狼疮鼠存活期。除实验动物外，系统性红斑狼疮患者也表现出血浆可溶性Blys明显升高[6,7]。Blys表达增强可能引起狼疮患者体内B细胞过度增殖，产生大量自身抗体，形成免疫复合物并沉积，从而导致组织器官损害[4]，所以Blys在红斑狼疮疾病发生和中起重要作用。目前关于Blys作用信号途径的研究显示，Blys主要通过与受体BR3相结合[8]，诱导与NF-kappaB(NF-κB)有关的抗凋亡活性，导致Bcl-2家族蛋白间的比例改变，主要是下调凋亡前蛋白Bax而上调抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL，从而减少B细胞的凋亡，影响其生长发育[9,10]。但调节系统性红斑狼疮 Blys表达上游因素的研究罕见。本文在体外检测狼疮患者外周血单个核细胞Blys基因和蛋白表达，探讨IL-10对Blys表达的调控作用。

    1   材料与方法

    1.1   研究对象

    25例系统性红斑狼疮患者，为来自2003年10月至2004年7月广州中山大学附属第一住院和门诊病人，均符合1982年美国风湿病协会制定的诊断标准，男2例，女23例，年龄(31±14)岁；20名健康志愿者，均为女性，年龄(28±10)岁。两组年龄、性别无显著性差异。

    1.2   细胞处理及分组

    ①抽取系统性红斑狼疮患者和健康人静脉血10 mL注入含50 μL肝素的无菌离心管，梯度密度离心法提取外周血单个核细胞（perpheral blood mononuclear,PBMCs)，用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×106/mL待用。② 在24孔培养板中加入PBMCs , 每孔1 mL，每份标本分2组，每组5孔，37 ℃、5% CO2培养4 h后，第1组加入IL-10(100 ng/mL，Sigma公司)，第2组为对照组(仅含RPML1640培养基)。③分别于培养0、6、12、24 h离心收集第1至第4孔PBMCs用于Blys mRNA的检测。④于72 h离心收集第5孔PBMCs用于膜结合型Blys蛋白检测。每孔细胞均进行台盼蓝拒染法检测细胞活力(活细胞达90%)。

    1.3   PBMCs Blys mRNA表达

    ① 按照Trizol试剂盒说明分别提取培养0、6、12、24 h后PBMCs总RNA。②半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：根据RT试剂盒(MBI公司)说明书逆转录合成cDNA作为PCR模板。RT-PCR引物序列 (Blys正链 5′-ACA GAA AGG GAG CAG TCA CG-3′，负链 5′-AAC GGC ACG CTT ATT TCT GCT-3′(393 bp)；内参照β-actin正链5′-GGA TTC CTA TGT GGG CGA CG-3′，负链5′-GGA ACC GCT CAT TGC CAA TG -3′(617 bp))（上海生物工程公司）。PCR扩增反应体系(25 μL)：去离子水15.25 μL，10×缓冲液2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，Blys正负链引物混和液2.5 μL，Tag DNA聚合酶0.25  μL，DNA模板1.5 μL。95 ℃预变性4 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s ，32个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，数码凝胶图像分析系统作条带密度扫描，结果以Blys与β-actin的比值(ABlys/β-actin值)表示。

    1.4   流式细胞仪检测PBMCs膜结合型Blys蛋白表达

    收集培养72 h PBMCs，0.5 g/100 mL多聚甲醛固定10 min，加破膜剂，室温15 min，加PE标记的抗人Blys单抗(R&D公司) 100 μL，室温20 min，PBS洗涤2次后上机检测。

    1.5   直接免疫荧光法检测Blys蛋白表达

    取1滴PBMCs悬液(1×106/mL)滴于载波片上，均匀涂开，风干后置于冰丙酮中固定。10 g/100 mL牛血清白蛋白 15 μL阻断30 min。加抗人Blys单抗15 μL，避光37 ℃孵育2 h于镜下检测。

    1.6   统计学处理 

    数据均以均数±标准差(ｘ±ｓ)表示，采用SPSS13.0统计分析软件包进行数据分析;SLE和对照组间及不同时间点间的差异采用重复测量资料的方差分析比较。流式细胞仪检测结果采用析因设计资料的方差分析比较。

    2   结   果

    2.1   培养基组PBMCs Blys mRNA表达

    不加刺激剂的培养基组(只含有培养基)中，PBMCs Blys mRNA在0、6、12和24 h不同时点的表达差异无统计学意义，狼疮患者Blys mRNA表达在不同时点高于健康对照（表1，图1）。

    2.2   IL-10刺激组PBMCs Blys mRNA的表达

    不同时间点间PBMCs Blys mRNA表达的差别具有统计学意义。IL-10刺激后，系统性红斑狼疮患者和健康对照PBMCs Blys mRNA表达6 h开始升高(6 h vs 0 h，P<0.001)，12 h达到高峰(12 h vs 0 h, P< 0.001；12 h vs 6 h, P< 0.001；12 h vs 24 h, P< 0.001)，24 h恢复刺激前水平(24 h vs 0 h，P >0.05)。狼疮患者Blys mRNA表达在不同时点均高于健康对照（表2，图1）。

    2.3   PBMCs 膜结合型Blys蛋白的表达及IL-10对其表达的影响

    根据析因设计资料的方差分析，流式细胞仪检测结果显示，系统性红斑狼疮患者PBMCs膜结合型Blys蛋白表达强于健康对照组，差别有统计学意义(F=60.54, P< 0.001)；IL-10可增强PBMC膜结合型Blys蛋白表达，差别有统计学意义（表3）。系统性红斑狼疮患者和健康对照组间和刺激物(IL-10)之间不存在交互作用。

    直接免疫荧光法激光共聚焦荧光显微镜检测PBMCs Blys蛋白表达，较直观的反应了Blys蛋白在细胞中的分布，Blys主要分布PBMCs的细胞膜上。同样的，狼疮患者Blys蛋白的表达强于健康对照组，而IL-10增强其表达（图2）。

    3   讨   论

    Blys由骨髓来源的细胞分泌，包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等，在外周血单个核细胞(PBMCs)中主要为单核细胞和活化的T细胞[1]。它是Ⅱ型跨膜蛋白，在体内以膜结合型和可溶型两种形式存在。系统性红斑狼疮是一个以抗自身抗原的自身抗体产生为特征的系统性自身免疫性疾病，但导致B细胞耐受性缺乏和启动自身抗体产生的原因尚不十分清楚，而内源性Blys可能是参与红斑狼疮B细胞过度活化的重要因素[4-7]。

    本研究前期工作已发现系统性红斑狼疮患者体内PBMCs存在Blys mRNA和膜结合型蛋白表达增强[11]。本实验再次证实，与正常对照相比狼疮患者PBMCs中Blys存在转录和翻译水平的异常。本实验采用激光共聚焦显微镜直接免疫荧光方法检测Blys蛋白表达，显示Blys主要在单个核细胞胞膜上表达，较直观的体现了Blys的定位和分布情况。

    目前关于Blys的研究主要集中在动物和B细胞肿瘤上，且对Blys作用下游信号的研究较为透彻，但对调节Blys表达上游因素的研究罕见，仅有Nardelli[12]等发现IL-10可增强正常单核细胞和单核细胞来源的肿瘤细胞Blys表达。本实验检测了IL-10对系统性红斑狼疮患者PBMC Blys基因和蛋白表达的影响，显示IL-10在体外可增强狼疮患者PBMCs Blys mRNA和蛋白表达。

    过去认为抑制性T细胞(Ts)功能或数量上的缺陷是导致狼疮B细胞过度活化的原因，而目前则认为T辅助细胞(Th)的病态活化是促使B细胞多克隆激活的主要原因。Th细胞主要分为Th1和Th2细胞，Th1细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子，诱导T细胞增殖和单核细胞活化，介导细胞免疫反应；Th2细胞分泌IL-4、IL-6、IL-10，参与介导体液免疫；Th1/Th2比例失衡可导致一系列免疫病理损害。系统性红斑狼疮则存在Th1/Th2比例失衡，其中以Th2细胞过度活化为主。在Th2细胞因子中， IL-10与系统性红斑狼疮发病关系非常密切，是目前狼疮中研究得较为深入明确的细胞因子。IL-10是一种多功能的细胞因子，能直接刺激B细胞增殖和分化，促进抗体产生。研究表明，狼疮患者PBMC IL-10 mRNA表达和培养上清IL-10水平均明显增高，并且与自身抗体产生和狼疮活动性密切相关[13]。IL-10还增强生发中心B淋巴细胞表达抗凋亡蛋白Bcl-2，使B细胞寿命延长[14]。除了直接促进B细胞的增殖和分化外，本文的结果提示IL-10还可能通过促进Blys的表达而间接影响B细胞的增殖、存活和分泌功能。

    对影响系统性红斑狼疮患者 Blys分泌上游因素的研究有助于进一步深入探讨狼疮发病机制以及寻找狼疮的新靶点。本研究结果显示系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的Blys基因和膜结合型蛋白的表达均增强，IL-10可促进Blys基因和蛋白的表达，因此，阻断IL-10的作用，有助于治疗体液免疫介导的系统性自身免疫病，如系统性红斑狼疮。已有人尝试应用小鼠抗IL-10单抗治疗数例狼疮患者，延缓了病情进展并延长其生存时间[15]。本实验为抗IL-10抗体应用于人类狼疮患者提供了一定的依据，当然抗IL-10抗体广泛应用于临床还需要更深入的研究和验证。

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