RhoA/Rho激酶信号通路在血管紧张素Ⅱ刺激心肌成 纤维细胞增殖和胶原合成中的作用
作者：汪祥海， 伍卫， 杨军， 方昶， 耿登峰， 黄至斌
【摘要】 【目的】 探讨RhoA/Rho激酶信号通路在血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）刺激心肌成纤维细胞（ cardiac fibroblasts，CFBs）增殖和胶原合成中的作用。【方法】 采用胰酶消化、差速贴壁法培养新生SD 大鼠CFBs,并用AngⅡ诱导CFBs增殖和胶原合成。采用四氮唑盐比色法测定细胞增殖,羟脯氨酸法测定CFBs胶原含量,RT-PCR检测RhoA/Rho激酶mRNA的表达，Western blot检测肌球蛋白结合亚基磷酸化（phosphorylation of myosin-binding subunit,MBS-P）表达作为Rho激酶功能活化的标志。【结果】 AngⅡ(10-7mol/L )刺激48 h可诱导新生SD大鼠CFBs的Rho激酶活化（Ｐ< 0.01），上调RhoA、Rho激酶mRNA表达(Ｐ<0.05, Ｐ< 0.05)；Rho激酶特异性抑制剂Hydroxyfasudil (H4413)对AngⅡ刺激的CFBs增殖与胶原合成具有明显的抑制作用(Ｐ< 0.05, Ｐ< 0.05)。【结论】 RhoA/Rho激酶信通路可能在调控AngⅡ刺激CFBs增殖和胶原合成中发挥重要作用。
【关键词】 心肌成纤维细胞； Rho激酶； 血管紧张素Ⅱ
Abstract：【Objective】 To investigate the role of RhoA/Rho-kinase signal pathway in cardiac fibroblasts(CFBs) proliferation and collagen synthesis induced by angiotensin Ⅱ(AngⅡ). 【Methods】 CFBs of neonatal Sprague-Dawley (SD) rats were isolated with the method of trypsin digestion and differential anchoring velocity. Stimulation of the CFBs with AngⅡinduced fibrosis model. Proliferation of CFBs was observed by MTT coloricmetric assay. Synthesis of collagen was observed by the hydroxyp roline. The expression of RhoA and Rho-kinase mRNA was examined using semi-quantitative RT-PCR analysis. The extent of phosphorylation of myosin-binding subunit (MBS-P)of myosin phosphatase was quantified by Western blot analysis, and it was used to evaluate the activity of Rho-kinase. 【Results】 Stimulation of neonatal SD rats CFBs with AngⅡ (10-7 mol/L ) significantly activated Rho-kinase(Ｐ< 0.01), and significantly increased the expression of RhoA and Rho-kinase mRNA(Ｐ< 0.05, Ｐ< 0.05). Pretreatment of CFBs with a Rho-kinase inhibitor, hydroxyfasudil (H4413), effectively inhibited AngⅡ-induced CFBs proliferation and collagen synthesis(Ｐ< 0.05, Ｐ< 0.05). 【Conclusion】 RhoA/Rho-kinase signal pathway maybe one of the most important signal transducer for AngⅡ-induced CFBs proliferation and collagen synthesis in neonatal SD rats.
Key words: cardiac fibroblasts; Rho-kinase; angiotensinⅡ
心室重塑的过程被认为是各种病因导致晚期心脏功能衰竭共同的发病机制。心室重塑包括心肌实质重塑和心肌间质重塑。近年来的研究显示，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是刺激心肌成纤维细胞（CFBs）增殖和胶原合成的一个重要因素，与心肌间质重塑、心肌纤维化密切相关。但AngⅡ促CFBs增殖和胶原合成的分子机制目前尚未完全清楚。小分子Rho GTP 酶家族是相对分子质量为(20～30) ×103 的Ras超家族成员,根据其序列和功能可分为3 个亚族,即Rho 、Rac 和Cdc42。现已发现的Rho 家族主要成员有RhoA、RhoB、RhoC 等,其中最重要的是RhoA［1］。Rho 激酶又称为Rho 相关激酶(Rho-associated kinase，ROCK),属于丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶家族成员,是RhoA下游最主要、最具特色的信号分子[2]。近期研究发现,RhoA／Rho 激酶通路可能参与调控心肌肥厚和血管平滑肌肥大，并与肺、肾、肝等器官的慢性炎症纤维化有关，但该信号通路在心肌间质重塑中的作用报道甚少。本研究旨在探讨RhoA/Rho 激酶信号通路对血管紧张素Ⅱ刺激心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的调控作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物
出生1～3 d的SD大鼠, 雌雄不拘,中山大学第二附属实验动中心提供。
1.2 主要试剂
AngⅡ、Rho激酶抑制剂Hydroxyfasudil (H4413)等为sigma 产品；小鼠抗大鼠波形蛋白单克隆抗体、血管平滑肌肌动蛋白单克隆抗体均购自武汉博士德生物试剂公司；山羊抗大鼠MBS-P单克隆抗体购自Santa Cruz公司； 总RNA提取试剂(Trizol )购自Gibco 公司； 逆转录试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；羟脯氨酸试剂盒购自南京建成公司；SABC试剂盒购自博士德生物试剂公司。
1.3 CFBs的分离、培养
取1～3 d龄的SD大鼠,无菌开胸,剪取心室,用D-Hanks液清洗,剪碎,用1.25 g/L 胰酶消化液反复消化后( 37 ℃恒温摇床摇动8～10 min) ,分别收集各次消化上清液,加等量100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基,离心,弃上清液,取沉淀加100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基,制成细胞悬液,接种培养瓶中,置37 ℃、5% CO2培养箱内培养。差速贴壁90 min,去除心肌细胞。实验采用3～6代细胞。
1.4 CFBs的鉴定
1.4.1 病理形态学观察 用倒置显微镜观察心肌成纤维细胞的形态学特征。
1.4.2 SABC法免疫组织化学染色 滴加正常山羊血清封闭液,室温20 min；滴加一抗工作液,37 ℃孵育60 min；采用山羊血清和PBS作为一抗替代物作阴性对照；PBS洗3次；滴加生物素化的山羊抗小鼠IgG,37 ℃孵育20 min；PBS洗3次；滴加试剂SABC,37 ℃孵育20 min；PBS洗4次；DAB显色,显微镜下控制显色时间,蒸馏水洗涤；苏木素复染。
1.5 MTT法测定
取对数生长期CFBs 5 ×103 个细胞接种于96孔板中, 37 ℃、5% CO2 及饱和湿度下培养24 h后换无血清培养基,继续培养24 h后,使细胞进入生长静止期，吸弃各孔培养基, 继之分组再培养48 h。实验分组(各组DMEM培养基中含100 mL/L 胎牛血清) : 含胎牛血清的DMEM培养基组；含AngⅡ10-7 mol/L组；含AngⅡ10-7 mol/L及H4413 10-５ mol/L组 ；含H4413 10-５ mol/L组。在分组培养后的96孔板每孔中加入5 g/L MTT 10 μL，置37 ℃4 h后，弃上清，加入100 μL DMSO震荡15 min后，在酶联免疫检测仪上490 nm处测定吸光度值(A490值) 。
1.6 羟脯氨酸测定及胶原量的
分组同MTT法,换用24孔培养板,药物作用48 h。操作步骤严格按试剂盒说明。
1.7 RT-PCR 方法检测 RhoA/Rho激酶mRNA的表达
用6孔培养板，各组药物培养48 h后收集细胞，用Trizol提取总RNA，紫外分光光度计检测纯度。反应分两步进行：取1 μL总RNA，在M-MLV逆转录酶作用下合成CDNA；再取2 μL逆转录产物进行PCR扩增反应。Rho激酶上游引物为5′-GAGCAACTATGA TGTGCCTGAAAAAT-3′，下游引物为5′-GATGTCGTTTGATTTCTTCTAC-3′，产物大小512 bp；RhoA上游引物为5′-GTAGAGT TGGCTTTATGGG-3′，下游引物为5′-CACTCC GTCTTGGTCTT-3′，产物大小345 bp；β-actin上游引物为5′-GGGACCTGACCGACTAC CTC-3′，下游引物为5′-GGGCGATGATCTTG ATCTTC-3′，产物大小245 bp 。PCR 反应条件：94 ℃变性1 min , 52 ℃退火 45 s ，72 ℃延伸1 min ，32个循环，最后72 ℃延伸7 min。每一PCR 反应至少重复3 次。PCR 产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，紫外透射反射仪观察扩增产物的大小及亮度并摄影。使用凝胶分析系统对扩增条带进行密度分析，以平均灰度值代表相应基因的表达量，并除以β-actin灰度值，所得数值作为各扩增产物mRNA的相对表达量。
1.8 Western blot检测肌球蛋白结合亚基磷酸化（MBS-P）表达
各组药物培养48 h后，弃培养液，用预冷PBS洗细胞2次,加入100 μL细胞裂解液，刮起细胞，超声粉碎30 s , 4 ℃ 12 000r/min 离心5 min ,吸取上清,BCA法测定总蛋白浓度。取30 μg的上述样品加样至150 g/L的SDS-PAGE凝胶,电泳。用转移缓冲液把凝胶上蛋白质转移至硝酸纤维膜上,膜在室温下用50 g/L脱脂奶粉封闭液封闭1 h，加入1 ∶ 1000稀释的山羊抗大鼠MBS-P单克隆抗体及β-actin多克隆抗体于4 ℃孵育12 h，然后加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗（1 ∶ 1000）室温孵育1 h，TBST 洗膜后用 ECL 液显影，将结果进行图像分析,以β-actin为内参照，测定各样品的MBS-P蛋白的相对表达量。
1.9 统计学处理
所有数据采用均数±标准差(ｘ±ｓ) 表示, 使用SPSS统计软件,采用2 × 2析因设计的方差分析, P < 0.05 为有统计学意义。
2 结 果
2.1 CFBs的形态及免疫组化鉴定结果
倒置显微镜观察(图 1) CFBs生长迅速, 2～3 d 即呈汇合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长。与心肌细胞不同，CFBs呈梭形或多角形，胞体较大，胞质透明，无自发性搏动。SABC 免疫细胞化学染色结果：光镜下见细胞呈梭形或多角形， 胞质中较多的棕黄色颗粒为染色阳性颗粒，波形蛋白染色阳性（图 2），平滑肌肌动蛋白染色呈阴性（图 3）,符合CFBs的染色特征。
2.2 AngⅡ对鼠CFBs的RhoA、Rho激酶mRNA表达影响及H4413干预
方差分析结果示AngⅡ与H4413对SD大鼠CFBs的RhoA、Rho激酶mRNA表达有交互效应（F=7.46和8.59），10-7 mol/L AngⅡ刺激大鼠心肌成纤维细胞48 h后 ,可显著提高RhoA、Rho 激酶mRNA表达（F=8.23和9.16），10-5 mol/L H4413预处理对RhoA、Rho 激酶mRNA表达无显著影响（F=0.025和1.38），但可抑制AngⅡ的作用。 (表1；图4，5)。
2.3 AngⅡ对鼠CFBs Rho激酶活性的影响及H4413干预
肌球蛋白结合亚基（MBS）是Rho激酶的主要底物之一，其磷酸化被认为是Rho激酶活化的重要标志，因此，我们检测磷酸化MBS 蛋白表达用于反应Rho激酶活性。对图6做图像分析，对照组、H4413组、AngⅡ组和AngⅡ+H4413组的MBS-P蛋白的相对表达量分别为：0.09±0.03、0.06±0.04、0.58±0.11和0.14±0.07 (n=3)。方差分析结果示, AngⅡ与H4413对CFBs的MBS-P蛋白表达存在交互效应（F=12.49，P< 0.01），10-7 mol/L AngⅡ可诱导MBS-P蛋白表达（F=15.74, P< 0.01）, 10-5 mol/L H4413 对MBS-P蛋白表达无显著影响（F=2.74, P >0.05），但可抑制AngⅡ诱导的MBS-P蛋白表达。可见，AngⅡ可诱导Rho激酶活化， H4413对AngⅡ诱导的Rho激酶活化具有抑制作用。
2 4 AngⅡ对鼠心肌CFBs增殖和胶原合成的影响及H4413干预
方差分析结果示AngⅡ与H4413对SD大鼠CFBs的CFBs增殖和胶原合成有交互效应（F=5.24和6.41）, 10-7 mol/L AngⅡ刺激大鼠心肌成纤维细胞48 h后, MTT (A490值)和胶原合成量均显著增高（F=7.38和8.51），10-5 mol/L H4413预处理对A490值和胶原合成量无显著影响（F=0.046和1.27），但可抑制AngⅡ的作用(表2)。
3 讨 论
心肌成纤维细胞（CFBs）增殖和胶原合成在心肌纤维化中起重要作用，心肌纤维化又是心功能由代偿向失代偿期转变的重要病理过程[3]。AngⅡ是促进心肌成纤维细胞（CFBs）增殖、胶原合成的一个重要因素。本研究发现，10-7mol/L AngⅡ具有促进CFBs增殖活力和胶原合成作用，这与国内外许多作者的研究相一致[4，5]。但AngⅡ刺激CFBs增殖和胶原合成受体后的确切的胞内信号转导机制目前尚未完全清楚。
小分子Rho GTP 酶家族具有广泛的生物学功能,除了对细胞骨架重排有重要调控作用外,亦参与调节细胞的局部黏附、迁移、聚集、增殖和基因转录等[1，6]。新近有研究发现，Rho 激酶可能参与调控AngⅡ诱导心肌肥厚和血管平滑肌肥大[7],另有报道 RhoA／Rho 激酶通路与SHR大鼠心血管重构及小鼠心肌梗死后左室重构有关，长期抑制Rho 激酶可显著改善心血管重构[2,8]。
本研究在培养的新生SD大鼠CFBs上观察到，AngⅡ（10-7 mol/L）在刺激CFBs增殖、胶原合成的同时可激活Rho 激酶，并明显上调CFBs的RhoA和Rho 激酶mRNA的表达水平，提示在AngⅡ刺激CFBs增殖和胶原合成中RhoA／Rho 激酶信号通路被活化。Hydroxyfasudil（H4413）是RhoA／Rho 激酶信号通路高度特异性的抑制剂,常应用于该信号通路的功能研究[9],我们用H4413 10-5 mol/L预处理CFBs，结果发现， H4413与AngⅡ对大鼠CFBs的Rho激酶活化和RhoA、Rho激酶mRNA表达有交互效应, 10-5 mol/L H4413可显著抑制10-7 mol/L AngⅡ刺激的CFBs增殖与胶原合成。从上述结果我们可以推论出，AngⅡ刺激CFBs增殖和胶原合成至少部分是通过RhoA／Rho 激酶信号通路所介导。
RhoA／Rho 激酶通路可能并非AngⅡ诱导CFBs增殖、胶原合成唯一的胞内信号转导通路，有学者报道，AngⅡ可通过结合AT1受体,以酪氨酸激酶途径激活细胞外信号调节激酶(ERK)引起心肌纤维化[9]；另有文献报道，AngⅡ可通过增加心肌成纤维细胞MAPK活性和DNA合成刺激转化生长因子β1 mRNA表达和蛋白合成的增加，进而引起心肌纤维化[10]。在调控AngⅡ刺激的CFBs增殖和胶原合成中，RhoA／Rho 激酶通路与ERK、MAPK间的信号转导关系有待进一步明确。
Rho 激酶有两种同源性极高的异构体形式 (ROCKα/ ROCK 2 和ROCKβ/ ROCK 1)，新近，利用基因敲除技术，有学者发现ROCK1在压力负荷致心肌间质纤维化中起重要作用[11]。在调控AngⅡ刺激的CFBs的增殖和胶原合成中，何种Rho 激酶亚型起主要作用，亦有待进一步研究。
【文献】
BURRIDGE K, WENNERBERG K. Rho and Rac take center stage[J]. Cell, 2004,116(2):167-179.
LOIRAND G, GUERIN P, PACAUD P, et al. Rho kinases in cardiovascular physiology and pathophysiology[J]. Circ Res, 2006,98(3):322-334.
GALLAGHER A M, BAHNDON T D, YU H, et al. Species variability in angiotensin receptor expression by cultured cardiac fibroblasts and the infracted heart[J]. Am J Physiol, 1998,247(3 pt 2):H 801-809.
张 伟, 杨 涛, 苏彦欣, 等. 双苯氟嗪对血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及其机制研究 [J]. 药通报,2006,22 (2):207-212.
KAWANO H, DO Y S, KAWANO Y, et al. Angiotensin Ⅱ has multiple profibrotic effects inhuman cardiac fibroblasts[J]. Circulation,2000,101(10):1130 - 1137.
TAKEUCHI S, KAWASHIMA S, RIKITAKE Y, et al . Cerivastatin suppresses lipopolysaccharide?鄄induced ICAM-1 expression through inhibition of Rho GTPase in BAEC[J]. Biochem Biophys Res Commun , 2000,269 (1): 97-102.
HIGASHI M, SHIMOKAWA H, HATTORI T, et al. Long?鄄term inhibition of Rho-kinase suppresses angiotensin Ⅱ?鄄induced cardiovascular hypertrophy in rats in vivo: effect on endothelial NAD(P)H oxidase system[J]. Circ Res，2003,93(8):767-775.
HATTORI T, SHIMOKAWA H, HIGASHI M, et al. Long?鄄term inhibition of Rho?鄄kinase suppresses left ventricular remodeling after myocardial infarction in mice[J]. Circulation, 2004 ,109(18):2234-2239.
MIURA M, HATA Y, HIRAYAMA K, et al. Critical role of the Rho-kinase pathway in TGF-beta2-dependent collagen gel contraction by retinal pigment epithelial cells[J]. Exp Eye Res, 2006, 82(5):849-859.
ZOU Y, KOMURO I, YAMZZAKI T, et al. Cell type-specific angiotensin Ⅱ?鄄evoked signal transduction pathways: critical roles of Gbetagamma subunit, Src family, and Ras in cardiac fibroblasts[J]. Circ Res, 1998, 82(3):337-345.
KAWANO H, DO Y S, KAWANO Y, et al. Angiotensin Ⅱ has multiple profibrotic effects in human cardiac fibroblasts[J]. Circulation, 2000,101 (10):1130-1137.
ZHANG Y M, BO J, TAFFET G E, et al. Targeted deletion of ROCK1 protects the heart against pressure overload by inhibiting reactive fibrosis[J]. FASEB J, 2006, 20(7):916-925.
