巨噬细胞ABCA1对Ox-LDL诱导的炎症因子 的调节及其意义
作者：郭志刚， 吴平生， 李建华， 赖文岩
【摘要】 【目的】 研究在氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）诱导作用下，ATP结合盒转运子A1（ABCA1）对巨噬细胞中细胞间黏附分子－1（ICAM-1）、单核细胞化学趋向蛋白－1（MCP-1）mRNA和蛋白质及白介素－1β（IL-1β）蛋白质表达的影响，在细胞水平证实ABCA1对动脉粥样硬化的影响。【方法】 用氟波酯(PMA)刺激THP-1细胞使之转变为巨噬细胞，Ox-LDL (30 ?滋g/mL)刺激3、6、12、24 h后，以荧光定量RT－PCR和Western蛋白印迹法及酶联免疫吸附法（ELISA）检测ABCA1、ICAM-1、MCP-1及IL-1β mRNA和蛋白质表达量；用反义寡核苷酸（100 nmol/L）抑制ABCA1的表达，观察Ox-LDL刺激下上述指标的改变。【结果】 给予Ox-LDL刺激后，巨噬细胞ABCA1、ICAM-1、MCP-1的mRNA和蛋白及IL-1β蛋白质表达均增高；给予反义寡核苷酸转染后Ox-LDL刺激3、6 h，上述指标的mRNA表达降低(P<0.01)，12、24 h蛋白质表达降低(P<0.01)。【结论】 在巨噬细胞，ABCA1可增加Ox-LDL诱导的炎症因子表达，参与动脉粥样硬化的发生。
【关键词】 ATP结合盒转运子A1； 氧化低密度脂蛋白； 巨噬细胞； 动脉粥样硬化； 炎症因子
Abstract:【Objective】 To evaluate the effects of ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1) on mRNA and protein expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and protein expression of interleukin-1β (IL-1β) in THP-1 macrophage induced by oxidized low density lipoprotein (Ox-LDL) in order to investigate the mechanism that ABCA1 contributes to atherosclerogenesis.【Methods】 Monocytic THP-1 cells were cultured with 100 nmol/L phorbol myristate acetate (PMA) for 72 hours to lead cells into THP-1 macrophage. Ox-LDL (30 ?滋g/mL) was added into culture media and THP-1 macrophage cells were harvested at 3, 6, 12, and 24 hours, respectively. The mRNA and protein levels of ABCA1, ICAM-1, MCP-1 and IL-1β were investigated by real-time fluorescent quantitative RT-PCR, Western blot, and ELISA methods. After phosphorothioate oligonucleotides of ABCA1 mixture were add to culture media at final concentration of 100 nmol/L, the same experiments were repeated. 【Results】 The mRNA and protein amounts of ABCA1, ICAM-1, and MCP-1 and also protein amount of IL-1β were increased after macrophage incubated with Ox-LDL. Transfected with antisense oligonucleotides of ABCA1, the expressive levels of mRNA were decreased at 3 and 6 hours (P< 0.01), and protein at 12 and 24 hours (P< 0.01). 【Conclusion】 ABCA1 could increase the expression of inflammatory cytokines in macrophage induced by Ox-LDL and contributed to atherosclerogenesis.
Key word: ATP-binding cassette A1 (ABCA1); oxidized low density lipoprotein; THP-1 macrophage; atherosclerosis; inflammatory cytokine
[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(1): 6-10] 动脉粥样硬化是一种慢性全身性疾病，也是冠心病及脑卒中最常见的原因，传统观点认为，高脂血症是引起动脉粥样硬化的主要原因之一，自从Ross[1]提出炎症学说后，已有许多证据支持动脉粥样硬化是一种炎症性疾病，氧化低密度脂蛋白（Ox?鄄LDL）可引起血管巨噬细胞炎症反应增强，导致动脉粥样硬化。ATP结合盒转运子A1(ABCA1)是转运细胞内磷脂和胆固醇的关键基因，ABCA1基因突变可导致Tangier病和家族性低高密度脂蛋白血症（FHA），使患者血浆高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）明显降低，并出现早发冠心病等改变[2]，但随着对ABCA1研究的深入，发现ABCA1不仅仅影响血脂，还与动脉粥样硬化及泡沫细胞形成有明显的关联[3]，本研究将人单核细胞株（THP-1）刺激转化为巨噬细胞， 观察在致动脉粥样硬化因素Ox?鄄LDL作用下， ABCA1对炎症因子mRNA、蛋白质表达的影响，以阐明 ABCA1在动脉粥样硬化形成中新的可能机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
Ox-LDL自己制备，抗ABCA1多克隆羊抗人抗体、抗细胞间黏附分子－1（ICAM-1）多克隆兔抗人抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体、辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠抗体购自Santa Cruz 生物技术公司，抗单核细胞化学趋向蛋白－1(MCP-1)单克隆小鼠抗人抗体购自研究与（R&D）公司，ECL Western杂交显影试剂盒购自安玛西亚（Amersham）公司，RNA逆转录试剂盒购自普洛麦格（Promega）公司，荧光定量PCR反应体系（MJ公司），引物合成（北京奥科生物技术公司），ELISA试剂盒购自博士德公司。
1.2 方 法
1.2.1 研究分组 Ox-LDL实验组、反义寡核苷酸组。Ox-LDL实验组指Ox-LDL刺激3、6、12及24 h，直接测定细胞ABCA1、ICAM-1、MCP-1、白介素－1β(IL-1β)的mRNA及蛋白质水平。反义寡核苷酸组指加入硫代修饰的反义寡核苷酸培养5 h后，再加入Ox-LDL刺激3、6、12、24 h，测定ABCA1、ICAM-1、MCP-1、IL-1β的mRNA及蛋白质水平。
1.2.2 巨噬细胞的培养及处理 复苏已有的人单核细胞株THP-1，取传3～4代后细胞，加入氟波酯(PMA，终浓度100 nmol/L)培养72 h，使之转变为巨噬细胞，每次实验前以无血清的RPMI1640培养12 h，使实验所用细胞处于静止状态。在无血清培养基中加入牛血清白蛋白2 mg/mL作为血清替代物，加入Ox-LDL （30 ?滋g/mL）刺激3、6、12、24 h，设未加刺激同时孵育24 h的细胞作为对照点。
1.2.3 Ox?鄄LDL的制备 人血浆LDL提取采用一次性密度超速离心法制备。新鲜人不抗凝血液，室温低速离心分离血清，用KBr调密度至1.30 g/mL，4 ℃以50 000 r/min离心5 h，收集LDL，于PBS中透析48 h，超滤除菌后4 ℃保存。LDL的氧化修饰采用经典的硫酸铜方法，无EDTA-LDL（1 mg/mL）置于含5 μmol/mL Cu2＋的PBS中，37 ℃温育24 h。修饰后的LDL置于含200 μmol/mL EDTA的PBS中透析24 h后4 ℃保存。修饰程度用硫代巴比妥酸反应物质测定法。
1.2.4 RNA的提取及RT-PCR检测 ABCA1、ICAM-1、MCP-1的基因表达 提取RNA后进行逆转录反应, 用MJ-RT-PCR反应体系SYBR Green 试剂盒进行PCR，内参照采用β-Actin。RT-PCR反应条件及PCR引物序列见表1。
1.2.5 Western blot分析 用细胞裂解液裂解细胞，取总蛋白50 μg进行变性，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳， ABCA1、ICAM-1、 MCP-1分别采用60 g/L、75 g/L、150 g/L凝胶，然后电转移于NC膜上，封闭NC膜过夜，漂洗后在4 ℃与抗ABCA1、ICAM-1、MCP-1一抗结合4 h，再与各自的二抗4 ℃结合2 h，最后采用ECL试剂盒显影。用机图形分析软件自动分析Western blot图形的大小及灰度。
1.2.6 ELISA检测细胞ICAM-1、MCP-1、IL-1β的表达 细胞培养同上，收集细胞，用细胞蛋白萃取液提取各试验组的蛋白，测蛋白浓度，依照试剂盒的操作步骤进行各组的检测。
1.2.7 ABCA1反义寡核苷酸对ABCA1，ICAM-1，MCP-1 mRNA和蛋白质表达的作用 细胞培养同上，将所用的细胞用PBS清洗，加入RPMI 1640培养基1.8 mL及脂质体和反义寡核苷酸的混合物0.2 mL（反义寡核苷酸终浓度100 nmol/L），孵箱内培养5 h后，用PBS清洗细胞，加入完全培养基继续培养8 h，然后按照步骤加入Ox-LDL进行mRNA及蛋白质的实验。ABCA1反义寡核苷酸的序列为：5′-CATGTTGTTCATAGGGTGGGTAGCTC-3′，全程硫代修饰。
1.3 统计方法
所有实验数据均来自3次重复实验并复孔测定（共6次），以ｘ±ｓ表示，并输入SPSS 10.0统计软件包进行统计分析。多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 Ox-LDL对巨噬细胞ABCA1、ICAM-1、MCP-1 mRNA的影响
Ox-LDL刺激3 h后即出现mRNA表达的增高，3、6、12、24 h ABCA1 mRNA比对照组分别增加18％、42％、35％、28％；ICAM-1 mRNA 分别增加19%、48%、30%、25%；MCP-1 mRNA分别增加15%、43%、38%、28%。高峰时间均为6 h。给予反义寡核苷酸刺激后，3、6 h ABCA1 mRNA较对照组分别降低28％、16％； 3、6 h ICAM-1 mRNA分别降低32%、18%；3、6 h MCP-1 mRNA分别降低26%、13%。以上各实验点ABCA1、ICAM-1及MCP-1与对照点比较差异均有极显著性(P< 0.01)；相对应的3，6，12 h时间点，反义寡核苷酸组与Ox-LDL实验组比较差异均有极显著性（P< 0.01；图1)。
2.2 Ox-LDL对巨噬细胞ABCA1、ICAM-1、MCP-1蛋白质的影响
Western Blot分析法显示Ox-LDL刺激3 h后即出现蛋白质表达的增高，3、6、12、24 h ABCA1蛋白质表达水平比对照分别增加21%、36%、59%、29%；ICAM-1蛋白质表达分别增加28%、44%、68%、53%；MCP-1蛋白质表达分别增加25%、38%、57%、 48%。高峰时间均为12 h。给予反义寡核苷酸刺激后，12、24 h ABCA1蛋白质表达较对照组分别下降11%、26%； 12、24 h ICAM-1蛋白质表达分别下降20%、32%； 12、24 h MCP-1蛋白质表达分别下降16%、29%。以上各实验点ABCA1、ICAM-1及MCP-1与对照点比较差异均有极显著性(P< 0.01)；相对应的6，12，24 h时间点，反义寡核苷酸组与Ox-LDL实验组比较差异均有极显著性（P< 0.01；图2, 3)。
2.3 Ox-LDL对巨噬细胞ICAM-1、MCP-1、IL-1β的影响
ELISA法检测显示Ox-LDL刺激3 h后即出现各指标增高，3、6、12、24 h ICAM-1比对照点分别增加22.8%、86.7%、103.8%、101.3%；MCP-1分别增加18%、111%、80%、40%；IL-1β分别增加33.8%、83.3%、58.2%、46.4%。给予反义寡核苷酸刺激后，3种炎症因子的表达与对照点比较也有增加，但与Ox-LDL实验组比较增加幅度明显降低。3、6、12、24 h ICAM-1较对照组分别增加 29.2%、28.4%、46.2％、56.7％；3、6 h MCP-1分别加46%、17%，12、24 h分别降低14％、22％；3、6、12、24 h IL-1β分别增加33.6%、26.2%、24.8%、13.9%。以上各实验点与对照点比较差异均有显著性(P< 0.01)。相对应的3 h时间点，反义寡核苷酸组MCP-1与Ox-LDL实验组比较差异有显著性（P< 0.05）；6，12，24 h时间点，反义寡核苷酸组ICAM-1、MCP-1及IL-1β与Ox-LDL实验组比较差异均有极显著性（P< 0.01；表2）。
3 讨 论
1914年Antischkow首次提出胆固醇和富含胆固醇的泡沫细胞与动脉粥样硬化的发生有关，现在认为在动脉粥样硬化的起始阶段，Ox?鄄LDL的细胞毒性和自由基的作用可损伤血管内皮细胞功能[4]，促使其分泌细胞黏附分子和化学趋向因子。血管内皮细胞分泌的ICAM-1可介导血液中的单核细胞黏附到激活的血管内皮细胞；损伤的血管内皮细胞还可分泌MCP-1，促使黏附的单核细胞进入血管壁并分化为巨噬细胞并分泌炎性细胞因子[5]，包括IL-1β、ICAM-1、MCP-1等，增加炎症细胞浸润，引起脂质在血管壁沉着，形成泡沫细胞及动脉粥样硬化斑块，造成动脉粥样硬化[6, 7]。Feng [8]研究Ox?鄄LDL引起炎症因子表达增加的机制，证明在人外周血单核细胞中Ox?鄄LDL通过p38α引起IL-1β表达增加。Jing [9]也证实p38与Ox?鄄LDL诱导的THP-1化学趋向性有关。这些资料表明Ox-LDL－p38α－IL-1β通路可能是导致动脉粥样硬化的机制之一。
Ox-LDL 对ABCA1也有明显影响，Tank [10]证实Ox-LDL可引起THP-1巨噬细胞中ABCA1 mRNA、蛋白质的表达及细胞内胆固醇外流增加，提高胆固醇逆转运，具有抗动脉粥样硬化的作用。
研究发现ABCA1除具有调节血脂的整体作用外，在单核/巨噬细胞中ABCA1是不依赖血脂调节发挥其抗动脉粥样硬化的作用[11]。Reddy 等[12]发现ABCA1共同参与胆固醇的逆转运和低密度脂蛋白的氧化；细胞中的22（R）-羟基胆固醇可通过增加ABCA1表达，从而提高动脉壁细胞介导的低密度脂蛋白氧化；用ABCA1的反义寡核苷酸抑制ABCA1表达，可阻止低密度脂蛋白诱导的脂质过氧化及单核细胞趋化活性。研究表明ABCA1通过调节动脉壁细胞中活性氧的释放，从而在动脉壁细胞介导的低密度脂蛋白的氧化修饰中发挥重要作用。因此可见，ABCA1可能具有抗动脉粥样硬化和致动脉粥样硬化双重作用。
Zhou [13]用Tangier病人和正常人单核细胞和巨噬细胞进行研究，发现Tangier病人巨噬细胞IL-1β自分泌水平低于正常人，用ABCA1反义寡核苷酸抑制ABCA1，可使Tangier病人巨噬细胞中脂多糖诱导的IL-1β分泌减少30～50％。格列本脲(glyburide)，黄溴酞（sulphobromophtaleine, BSP）为不同类型的ABCA1拮抗剂，分别可抑制ABCA1的转运功能达88％、79％，Hamon[14]观察用格列本脲抑制ABCA1表达后，鼠腹腔巨噬细胞及人血液单核细胞IL-1β显著降低，呈剂量依赖性，说明抑制ABCA1可减少巨噬细胞中IL-1β的分泌。一些研究揭示ABCA1还调节巨噬细胞中载脂蛋白-E、α-维生素E的分泌。而Kaplan [15]对ABCA1表达的信号转导机制研究表明，p38抑制剂（PD169316）显著降低THP-1细胞中脂多糖诱导的ABCA1的表达，表明p38可增加ABCA1的表达。
我们的实验看到，THP-1巨噬细胞在Ox-LDL刺激下引起ABCA1的mRNA和蛋白质表达水平增加，同时炎症因子IL-1β、ICAM-1、MCP-1的mRNA及蛋白质表达水平也增加；予反义寡核苷酸抑制ABCA1后，IL-1β、 ICAM-1、MCP-1的mRNA及蛋白质表达水平明显降低。本研究直接表明在巨噬细胞水平，ABCA1可增加Ox-LDL诱导的炎症因子表达，参与动脉粥样硬化的发生。
结合以上资料我们提出，在巨噬细胞中可能存在Ox-LDL－p38α－ABCA1－IL-1β通路，继而导致ICAM-1、MCP-1增加。在整体水平，ABCA1具有增加高密度脂蛋白胆固醇及逆胆固醇转运作用，从而抗动脉粥样硬化，但在细胞水平，ABCA1还具有增加炎症因子表达的作用，其深入的调控机制值得进一步研究。
【】
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