利多卡因对缺氧/复氧培养大鼠心肌细胞c-fos表达及LDH释放的影响

【摘要】  目的：研究利多卡因对缺氧/复氧培养大鼠心肌细胞LDH漏出及c-fos表达的影响。方法：建立SD大鼠心肌细胞原代培养及缺氧/复氧模型。将40孔原代培养大鼠心肌细胞分为5组，每组8孔。Ⅰ组为对照组；Ⅱ组缺氧2h复氧3h；Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组与Ⅱ组比在缺氧前开始分别加入利多卡因50 μmol·L-1、100 μmol·L-1和150 μmol·L-1。复氧3 h时用生化比色法测定培养基中乳酸脱氢酶（LDH）活力。将75孔细胞同上分为5组，在复氧2 h时用免疫组化法和图像平均灰度分析法测定c-fos的表达。结果：3种浓度利多卡因均能减少心肌细胞LDH漏出（P<0.05）。Ⅱ组与Ⅰ组比c-fos表达明显增加，Ⅵ组和Ⅴ组与Ⅱ组比较c-fos表达明显被抑制，平均灰度值差异有统计学意义（P<0.05）。结论：3种浓度的利多卡因能防治心肌细胞缺氧/复氧损伤，并且呈剂量相关性。

【关键词】  心肌细胞；缺氧/复氧；c-fos；利多卡因

    [Abstract]   Objective: To observe the effect of lidocaine on c-fos expression in cultured cardiac myocytes of neonatal rats and the concentration of lactate dehydrogenase(LDH) in culture medium during reoxygenation. Methods: Original cultured cardiomyocytes of SD rat and hypoxia-reoxygenation injuried immature cariomyocyte were established. The 40 caves of cultured cardiac myocytes were divided into 5 groups: groupⅠ as control;group Ⅱ as hypoxia-reoxygenation(hypoxia 2 hours-reoxygenation 3 hours)control; With comparaded to group Ⅱ,the groups Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ and Ⅵ were treated with lidocaine(50 μmol·L-1,

    100 μmol·L-1 and 150 μmol·L-1) since hypoxia respectively. Immunohistochemistry and mean gray were used to estimate the effect of lidocaine on expression of c-fos in cultured rat cardiomyocyte of each group 2 hours after reoxygenation. Release of lactate dehydrogenase of the cardiomyocytes of each group was investigated and determined as injury index of cardiomyocytes. Results: Release of lactate dehydrogenase was inhibited by lidocaine in 3 kinds of density,and expression of c-fos of the cardiomyocytes was significantly inhibited by lidocaine in 100 μmol·L-1 and 150 μmol·L-1(P<0.05) .Conclusion: Hypoxia-reoxygenation injury of the cardiomyocyte was released, then the expression of c-fos during reoxygenation was inhibited by lidocaine.

    [Key words]   Cardiomyocyte; Hypoxia-reoxygenation; c-fos; Lidocaine

    心肌缺血/再灌注损伤是一临床常见的病理现象。其机制及有效防治措施的研究在不断深入。抗心律失常药利多卡因（lidocaine）有抗氧化等作用，可减轻心肌缺血再灌注损伤。本实验观察利多卡因对缺氧/复氧培养大鼠心肌细胞应激蛋白c-fos表达及乳酸脱氢酶（LDH）释放的影响。

    1   材料和方法

    1．1   试剂   Fos单克隆抗体为Santa Cruz 公司产品，ABC试剂盒和DAB购自上海华美公司。DMEM培养基为Gibico 公司的产品。

    1．2   大鼠心肌细胞培养   参照Webster 等的方法，在无菌条件下取出生1~3 d的新生SD大鼠心室肌，洗除血块，剪碎成1 mm3组织块后用胰酶消化，收集细胞。用差速贴壁分离法去除非心肌细胞。用含15%胎牛血清的DMEM培养基稀释成适当浓度细胞悬液，按一定密度接种于明胶铺底的24 孔细胞培养板。每24 h更换培养基1次。将生长良好，同步搏动明显的原代培养心肌细胞用于实验。

    1．3   缺氧/复氧心肌细胞模型的建立   在用于实验的细胞中换入无血清DMEM 培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中孵育12 h 。然后快速换入经95% N2-5%CO2 充分平衡的低糖无血清DMEM 培养基，并将培养板迅速放入95% N2-5%CO2气体平衡的缺氧装置内，Detex-Ommeda 气体检测仪测得装置排气口氧浓度<1%。细胞缺氧2 h后迅速换入高糖DMEM 培养基，并放入37℃ CO2培养箱中复氧 。

    1．4   实验分组   将40 孔同步搏动良好，密度无明显差别的原代培养心肌细胞随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组，在实验前均换成无血清培养基孵育5 h。Ⅰ组不缺氧，余四组缺氧2 h、复氧3 h。其中，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组从缺氧开始分别加入利多卡因50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、150 μmol·L-1，Ⅱ组未用利多卡因处理。Ⅰ组同步更换无血清高糖培养基。在复氧3 h 时用生化比色法测定每孔培养基中LDH含量。

    将另外75孔细胞也随机均分5组，每组与以上的40 孔细胞处理相同。在复氧2 h 时，用免疫组化法测定心肌细胞c-fos表达。

    1．5   fos-ABC免疫组化法及常规染色法   培养细胞复氧2 h后用4%多聚甲醛固定5 min（室温）；0.3%TritonX-100破膜5 min（室温）；37℃下10%正常羊血清封闭30 min后用ABC法检测Fos的表达（37℃）。Fos抗体的浓度为1∶200，作用时间为2 h。羊抗兔IgG和AB液的浓度均为1∶50，在37℃下分别作用30 min。以上各步间分别用0.01 mol·L-1 PBS洗3次；各组标本用DAB（1∶50）显色10 min；用乙醇梯度脱水；晾干（室温）；中性树脂封片。

    1.6   图像分析和统计学方法   将免疫组化细胞片输入Leica Qwin图像分析系统，测定相同面积阳性细胞密度最高区域的平均灰度值。所有实验数据均采用x±s表示。组间比较采用SPSS统计软件作单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

    2   结      果

    2．1   LDH的漏出   与对照组比，心肌细胞在复氧3h 时LDH 漏出明显增加（P<0.05），说明心肌细胞受到明显的缺氧/复氧损伤。给予3种浓度的利多卡因处理，能不同程度减少心肌细胞LDH 的漏出。见表1。

    3．2   fos蛋白的表达   与未缺氧组（Ⅰ组）比较，缺氧/复氧组（Ⅱ组）fos 表达阳性细胞明显增加，平均灰度值有显著差异（P<0.05）。缺氧开始给予利多卡因100 μmol·L-1和 150 μmol·L-1，与缺氧/复氧组（Ⅱ组）比平均灰度值有显著差异（P<0.05）。见表2。

    3   讨      论

    正常的心肌、血管平滑肌和血管内皮细胞中存在c-fos基因。c-fos原癌基因为即早基因之一，在静止的细胞受外界刺激时早期快速表达。在心、脑、肝和肾等脏器的缺血再灌注模型上都发现了c-fos基因的诱导表达。它虽然是心血管系统生长发育所必需的基因，也是该系统应激反应所必需的基因[1]。

    研究发现心肌缺血再灌注也引起c-fos基因的迅速表达[1，2]。在心肌缺血再灌注损伤中，fos的表达可能与蛋白质合成抑制、Ca2+、 IP3、cAMP等密切相关。缺血/再灌注能引起心肌细胞内钙超载、能量代谢障碍等。心肌细胞内游离钙的增高及IP3、cAMP的激活通过磷酸化转录因子等诱导c-fos基因的转录。心肌细胞在缺血缺氧时还产生大量氧自由基，氧自由基也可诱导原癌基因c-fos的表达。原癌基因c-fos等的表达程度还与心肌细胞复氧损伤程度及细胞内游离钙水平有关[3]。此时Fos 蛋白作为第三信使，调控其他基因的表达，使细胞增殖及启动细胞修复过程。有研究发现c-fos基因的诱导表达仅出现在再灌注期，在心肌缺血再灌注模型上发现，单纯缺血组心肌细胞中未见c-fos基因诱导明显增加。因此c-fos基因被认为是再灌注损伤的特征性指标之一。

    在心肌胞浆Ca2+ 浓度的调节中, 细胞膜钠泵和肌浆网钙泵起着重要作用。利多卡因是临床常用的局麻药和抗心律失常药。有研究认为利多卡因能促进细胞膜钠泵和肌浆网钙泵功能的恢复。早期研究就利多卡因对缺血缺氧心脏的作用的说法不一，可能与利多卡因剂量有关。利多卡因还是一种非特异性膜稳定剂，抑制动作电位形成，加强细胞膜的稳定性。Wyman等研究发现，急性心肌梗死患者预防性应用利多卡因能明显降低融栓后室颤的发生率[4]。

    本实验发现50 μmol·L-1、100 μmol·L-1和 150 μmol·L-1 3种浓度的利多卡因均不同程度的减少LDH漏出（P<0.05），减轻心肌细胞的损伤。缺氧/复氧使心肌细胞核Fos蛋白阳性明显增强。100 μmol·L-1和 150 μmol·L-1利多卡因能明显降低fos蛋白的表达，说明利多卡因明显减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤，有心肌保护作用。

【】
  [1] Ruel M, Bianchi C, Khan TA, et al. Gene expression profile after cardiopulmonary by pass and covrdioplegic arrest[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2003,126（5）:1521-1530.

[2] Nelson DP, Wechsler SB, Miura T, et al. Myocarial immediate eary gene activation after cardipulmonary bypass with cardiac ischemia-reperfusion[J]. Am Thorac Surg, 2002, 73(1):156-162.

[3] 康进朝，刘维永，蔡振杰，等. SD鼠未成熟心肌细胞缺氧/复氧期c-fos, c-myc mRNA 的表达[J]. 第四军医大学学报，2000，21（5）：586-588.

[4] Wyman MG, Wyman RM, Cannom DS，et al. Prevention of primary ventricular fibrillation in acute myocardial infarction with prophylactic lidocaine[J]. Am J Cardiol, 2004,94(5):545-551.