抗CD20阳性淋巴瘤单抗真核表达载体的包装及增殖
【关键词】 单克隆抗体 逆转录病毒载体 包装细胞 病毒滴度
在我国，恶性淋巴瘤在儿童和青年中所占比例较高 [1]。大部分恶性B细胞淋巴瘤呈CD20高表达状态，利妥昔单抗是针对CD20抗原的单克隆抗体药物，能准确地识别并与之结合，并通过人体免疫清除这些肿瘤细胞[2，3]，然而该药物单独B细胞淋巴瘤的有效率仅达到48%[4]。本实验用包装细胞对抗CD20阳性淋巴瘤单抗真核表达载体PLNCX/anti-CD20-scFv-Fc-ζ进行包装，并通过测定病毒滴度的方法来检测其增殖情况，报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 抗CD20阳性淋巴瘤单抗真核表达载体PLNCX/anti-CD20-scFv-Fc-ζ是由前一步实验人员将PLNCX/anti-CD20-scFv-Fc质粒与TCR的ζ重组构建而成。PA317与NIH3T3包装细胞购自院上海细胞库。脂质体(LIPOFECTAMINETM) 购自美国invitrogen公司。 PCR试剂购自中日合资宝生物工程(大连)有限公司。 G418 (CALBiochem)、DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s medium) 培养基均购自Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1 用碱裂解法提取含真核表达载体PLNCX/anti-CD20- scFv-Fc-ζ质粒。
1.2.2 应用脂质体载体介导方法将真核表达载体PLNCX/anti-CD20-scFv-Fc-ζ转染至PA317包装细胞。转染前24 h，将对数生长期的PA317细胞按2 ml/孔加入6孔培养板，并用单无DMEM培养液将细胞配成105个/ml。转染当天，按脂质体试剂操作说明书的优化组合条件进行实验，将真核表达载体转染至PA317细胞，并将未转染的PA317细胞设为对照组。
1.2.3 包装后用其上清转导NIH3T3细胞，用G418筛选出阳性克隆并测定真核表达载体PLNCX/anti-CD20-scFv-Fc-ζ基因浓度相当于逆转录病毒滴度(cfu/ml)=每培养瓶平均克隆数×传代比例/新加PA317细胞上清体积。
1.2.4 用TRIZOL法提取未转染和转染后PA317细胞的基因组DNA。
1.2.5 采用PCR检测的整合情况，并证明所产生的重组病毒DNA没有发生重排或丢失。以TCR-ζ的CDNA设计引物，序列如下：
上游引物：5' ATTATTATCGATAGAGTGAAGTTCAGCAGGAG
下游引物：3' ATTATTATCGATTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTG
2 结果
2.1 PA317 抗性克隆的形成 经脂质体介导将真核表达载体PLNCX/anti-CD20-scFv-Fc-ζ导入PA317细胞，并用G418筛选21 d可得到大小不等的细胞克隆，而对照组无细胞克隆形成且绝大部分死亡，说明基因转导及整合已经成功（如图1所示）。此后逐渐将长大的抗性克隆局部消化并转移到6孔板，再传至25 ml培养瓶内。收集培养上清用以转染NIH3T3 细胞。
2.2 基因表达浓度的测定 通过挑选出5个生长良好的克隆按病毒滴度公式计算得到病毒滴度(×107，cfu/ml)为1.70，1.33，1.20，1.93，2.01。
2.3 目的基因整合的鉴定 用PCR 扩增及电泳鉴定基因的整合情况: 发现阳性克隆细胞基因组都扩增出336 bp 的目的基因片段电泳条带，而未转基因的PA317细胞DNA则无此条带(见图2)，说明抗CD20阳性淋巴瘤单抗真核表达载体已在PA317细胞基因组上稳定整合。
3 讨论
脂质体转染法的原理[5]是脂质体通过和样品中DNA相互作用，形成脂质体-DNA复合物。这种脂质体DNA复合物可以吸附于靶细胞表面，通过脂质体膜与细胞膜融合而将外源DNA导入细胞内。我们使用逆转录病毒载体来介导[6]，将构建于逆转录病毒载体上的真核表达载体PLNCX/anti-CD20-scFv-Fc-ζ通过脂质体转染到靶细胞。逆转录病毒载体除了具有可转染的靶细胞种类多、转染效率高等优点外，还可整合至靶细胞染色体中，进行转录复制，从而得到稳定表达[7]。
将目的基因导入靶细胞是基因过程中的一个重要环节，其效率的高低将直接影响基因治疗的效果甚至成败。而逆转录病毒载体介导的基因转移中高滴度感染性逆转录病毒包装细胞系的获得，对目的基因转导染效率至关重要。我们所采用的逆转录病毒载体PLNCX来源于小鼠白血病病毒。在改建中其gag、env、pol三部分编码野生型病毒颗粒所必需的基因被去除，无法编码病毒结构蛋白，而包装细胞则是已经人为导入了表达病毒结构蛋白基因的细胞系，故载体需要经过包装细胞的反式补偿才能装配成病毒颗粒[8]。包装的子代病毒颗粒以芽生的方式从包装细胞膜分泌至培养上清，具有感染性但无复制能力，即建立了产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系。PA317细胞是目前较广泛使用的第二代包装细胞，用它制备的逆转录病毒可以感染人和其他哺乳动物细胞，是一种广泛使用、 较安全的包装细胞。
我们的结果显示，PA317包装细胞系，能够成功包装真核表达载体PLNCX/anti-CD20-scFv-Fc-ζ，并建立稳定的高浓度阳性细胞克隆。研究表明，PA317细胞转染后筛选出的细胞株，其病毒滴度均大于1×107 cfu/ml，在利用NIH373细胞测定病毒的同时，也从实验的角度证明，包装后的逆转录病毒能对哺乳动物的靶细胞进行有效的感染，进而整合到宿主细胞染色体DNA中稳定长期表达。 在选择检测基因时我们选用了载体基因检测法，应用逆转录病毒载体的多克隆位点引物扩增出TCR-ζ片段，证实外源基因已在PA317细胞染色体基因组上稳定整合。
【】
[1] Baris D, Zahm SH. Epidemiology of lymphomas[J].Curr opin in oncol, 2000, 12(5):383-394.
[2] Kikuchi A, Kawada H, Iwaki Y,et al. Measurement of rituximab concentration in the cerebrospinal fluid in CNS lymphoma [J]. Rinsho Ketsueki, 2004,45(12):1255-1257.
[3] Karamouzis MV, Apostolikas N, Georganta C,et al. Case of relapsed CD20(+) mixed- cellularity Hodgkin disease treated with sequential rituximab and radiotherapy[J]. Am J Hematol, 2004,77(4):418-419.
[4] 赖增祖,熊东生,范东梅,等. 抗CD20嵌合Fab'片段对B淋巴细胞的生长抑制作用[J].通报,2001,46(1):61-65.
[5] 司徒镇强,吴军正. 细胞培养[M] . 西安:世界图书出版社,1996: 279 -280.
[6] 白然,李昌臣. 人胰岛素原基因在体外培养的NIH3T3 细胞中的基因转移和表达的研究[J] . 中华内分泌代谢杂志,2000,16 (1) :34-37.
[7] Patijn GA, Lieber A, Meuse L, et al. High2efficiency retrovirus2me2 diated gene transfer into the livers of mice [J]. Human Gene Therapy, 1998, 9 (10):1449-1456.
[8] Miller AD, Buttimore C. Redesign of retrovrus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus produc-tion [J]. Mol Cell Biol,1986, 6 (8):2895-2902.
