L-精氨酸对糖尿病大鼠坐骨神经损伤的保护作用

                   作者：陈秀芳，董敏，金晓冬，雷康福 金丽琴  

【摘要】  目的:探讨L-精氨酸（L-Arg）对糖尿病(DM)大鼠坐骨神经损伤的保护作用及其机制。方法:用链脲佐菌素制备糖尿病模型。SD大鼠随机分为正常对照组（NC组）、DM组、L-Arg组（L-Arg组）。L-Arg治疗12周后，测定三组大鼠血清、坐骨神经组织一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性及血浆内皮素-1(ET-1)、降钙素基因相关肽(CGRP)含量，以及坐骨神经组织Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性及神经元型NOS（nNOS）、醛糖还原酶（AR）基因的表达。结果:DM组大鼠血清、坐骨神经NO含量和NOS活性、血浆CGRP含量及坐骨神经Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性和nNOS mRNA 的表达均明显低于NC组（P<0.01或P<0.05），而血浆ET-1含量、坐骨神经AR mRNA的表达均明显高于NC组（均P<0.01）；经L-Arg治疗后，上述改变逆转，与DM组比较差异有显著性（P<0.01或P<0.05）。结论:L-Arg对DM大鼠坐骨神经损伤具有一定的保护作用，其机制可能与改善神经血供及抑制多元醇代谢途径有关。

【关键词】  L-精氨酸；糖尿病；坐骨神经；一氧化氮；内皮素-1；降钙素基因相关肽；醛糖还原酶；大鼠

    Abstract:  Objective: To investigate the effects and mechanisms of L-arginine (L-Arg) on preventing and treating sciatic nerve injury of experimental diabetic rats. Methods: The diabetes mellitus(DM) rats models were made by intraperitoneal injection of streptozotocin (60 mg/kg body weight), and three groups, including normal control group （NC group）, DM group, L-Arg treatment group (L-Arg group) were allocated at random. After the supplementation of L-Arg (300 mg·kg-1·d-1) for 12 weeks, the rats were sacrificed. The nitric oxide (NO) content and nitric oxide synthase (NOS) activity in serum and sciatic nerve, plasma endothelin-1 (ET-1) and calcitonin gene-related peptide (CGRP) content were determined. The activities of Ca2+-ATPase, Na+-K+-ATPase and the mRNA expression level of neuronal NOS (nNOS) and aldose reductase (AR) of sciatic nerve also were measured.  Results: The NO content and NOS activity in serum and sciatic nerve, plasma CGRP content, and Ca2+-ATPase, Na+-K+-ATPase activities and nNOS mRNA expression level in sciatic nerve of DM group were significantly lower than those of NC group (P<0.01 or P<0.05 respectively), but plasma ET-1 content and AR mRNA expression level in sciatic nerve were significantly higher than those of

    NC group (P<0.01 respectively). But in L-Arg group, the above changes were reversed, there were significant differences compared with those of the DM group (P<0.01 or P<0.05 respectively). Conclusion: L-Arg plays preventive and remedial roles in diabetic sciatic nerve injury. Improving the level blood supplying and inhibiting polyol metabolic pathway may be its mechanisms.

    Key words:  L-arginine; diabetes; sciatic nerve; nitric oxide; endothelin-1; calcitonin gene-related peptide; aldose reductase; rats

    糖尿病神经病变是糖尿病常见的慢性并发症之一，发病率高达60%～90%[1]，其发病机制尚未完全阐明。一氧化氮 (nitric oxide，NO)作为一种新型细胞信使分子、神经递质，在神经生理和神经病理中的作用日益受到重视，与糖尿病神经病变的发生密切相关。L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）作为NO合成的前体物质，具有促进体内NO合成、降血糖、促进胰岛β细胞分泌胰岛素等作用[2]。我们以往的研究初步表明，L-Arg对糖尿病大鼠多个脏器（心肌、肾脏、大脑、睾丸等）氧自由基损伤具有保护作用[3,4]。本实验采用链脲佐菌素诱导制备糖尿病大鼠模型，观察L-Arg对糖尿病大鼠血液NO、内皮素-1（endothelin-1，ET-1）、降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）含量及坐骨神经组织神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)、醛糖还原酶（aldose reductase，AR）基因表达和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）、Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性等的影响，探讨L-Arg在防治糖尿病大鼠坐骨神经损伤中的作用及其机制。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物  清洁级(Ⅱ级)雄性SD大鼠50只，体重180～220 g，由温州医学院实验动物中心提供(温医动字2005-0061号)。

    1.2  主要药品与试剂　链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、L-精氨酸盐酸盐均为美国Sigma公司产品；ET-1、CGRP放免试剂盒由解放军总东亚免疫技术研究所提供；NO、NOS、Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase检测试剂盒购自南京建成生物工程公司；Trizol reagent RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、DNA Marker由由宝生物工程（大连）有限公司提供；nNOS、AR及GAPDH引物序列由上海生物工程技术服务有限公司合成；血糖仪及测试条由强生()医疗器材有限公司提供。

    1.3  动物分组和处理  随机取12只大鼠作为正常对照组（NC组），余38只大鼠禁食12 h后，用链脲佐菌素60 mg/kg一次性左下腹腔注射，72 h后取尾血用快速血糖仪测血糖，≥16.8 mmol/L为糖尿病大鼠[5]；再将糖尿病大鼠随机均分为二组：糖尿病未治疗组(DM组)，L-精氨酸治疗组(L-Arg组)，每只每天腹腔注射L-精氨酸盐酸盐，剂量为300 mg/kg体重。正常对照组及糖尿病未治疗组每只每天腹腔注射等体积生理盐水，各组大鼠每天在规定时间内用药，于同等条件下饲养12周。

    1.4  标本采集及生化指标测定  大鼠给药处理12周后，股动脉放血处死，分别留取两管血液，一管不含抗凝剂，常规分离血清，-20 ℃冰箱保存待测NO含量和NOS活性；另一管中含10%EDTA-Na2 30μl和抑肽酶40μl，于 4 ℃ 3000 r/min离心10 min后分离血浆，置-20 ℃冰箱中保存待测ET-1、CGRP含量。迅速分离两侧坐骨神经，一条放入液氮中速冻过夜后移至-70 ℃冰箱中保存待测nNOS、AR mRNA含量；另一条用冷生理盐水冲洗后，称重，加入4 ℃预冷生理盐水，在冰浴条件下置匀浆机上10 000 r/min×10 s×3次，制备10%匀浆，4000 r/min离心10 min，取上清液-20 ℃保存待测NO含量及NOS、Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性。其中NO含量用硝酸还原酶法，NOS活性用化学比色法，Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性用定磷法，ET-1、CGRP含量用放射免疫分析法测定，均按试剂盒说明书操作；以双缩脲法测定蛋白质含量。

    1.5  坐骨神经组织nNOS、AR mRNA表达的测定  取冻存的坐骨神经组织，经Trizol一步法提取总RNA，紫外分光光度法定量后，按照逆转录试剂盒说明，以Oligo(dT)为引物合成cDNA，-20 ℃保存备用。根据Genebank资料，以nNOS、AR mRNA和GAPDH mRNA为模板，用软件Primer 3设计引物(见表1)。优化PCR条件，分别进行nNOS、AR与GAPDH的共扩增。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像仪观察，用Image Master 软件半定量分析条带峰面积，分别nNOS、AR与GAPDH峰面积的比值。

    1.6  统计学处理方法  数据用均数±标准差(±s)表示，各组间比较采用完全随机方差分析(One-way ANOVA)，组间行LSD(Least-significant difference)检验。

    2  结果  

    2.1  血清NO含量、NOS活性和血浆ET-1、CGRP含量的变化  DM组大鼠血清NO含量、NOS活性及血浆CGRP含量均显著低于NC组（P<0.01或P<0.05），而血浆ET-1含量显著高于NC组（P<0.01）。补充外源性L-Arg后，血清NO含量、NOS活性及血浆CGRP含量明显升高（P<0.01或P<0.05），而血浆ET-1含量明显降低（P<0.01）（见表2）。

    2.2  坐骨神经组织NO含量和NOS、Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性的变化  DM组大鼠坐骨神经组织NO含量及NOS、Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性均明显低于NC组（均P<0.05），给予L-Arg后，上述改变逆转，与DM组比较差异有显著性（均P<0.01），见表3。

    2.3  坐骨神经组织nNOS和AR mRNA的表达  DM组大鼠坐骨神经组织nNOS mRNA的表达明显低于NC组（P<0.01），而AR mRNA 的表达明显高于NC组（P<0.01）。L-Arg可上调坐骨神经组织nNOS mRNA 的表达（均P<0.05），抑制AR mRNA的表达（P<0.01），见表4和图1、图2。

    3  讨论

    糖尿病神经病变的发病机理涉及多种因素的共同作用，目前较为公认的是代谢障碍和血管损伤学说。NO被认为是连接糖尿病神经病变代谢学说与血管学说的桥梁，在糖尿病神经病变的发生中占有重要地位[6]。在机体内，NO由L-Arg和O2在NADPH、BH4等辅助下经NOS催化合成。NOS是NO合成的限速酶，有3种亚型，内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)、神经元型NOS(neuronal NOS，nNOS)和诱导型NOS(inducible NOS，iNOS)。NO作为机体内重要的信使分子和效应分子除可扩张血管外，还具有抑制血小板聚集、抑制血管平滑肌细胞增殖、防止血管痉挛和血栓形成等作用[7]。本实验结果显示，糖尿病组大鼠坐骨神经组织nNOS mRNA表达及NOS、Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性和NO含量均明显低于正常组，提示糖尿病时坐骨神经组织NO合成不足，神经内膜血管舒张障碍，血流量减少，神经组织缺血缺氧，造成坐骨神经组织结构或功能受损。其机制可能是糖尿病状态下机体L-Arg水平降低，使NO合成底物不足而致NO合成减少[2]；同时糖尿病长期高血糖激活多元醇代谢途径的关键酶--醛糖还原酶（AR），使NADPH的消耗增多，使同样以NADPH为必需辅助因子的NOS活性受到抑制，NO合成减少；而且NO的减少可以介导神经组织AR活性的增加[6]，使多元醇代谢途径增强，使NO的合成进一步减少。而NO的减少同时可以介导神经组织Na+-K+-ATPase活性的降低[6]。虽然本实验未检测AR的活性，但我们发现糖尿病组大鼠坐骨神经组织AR mRNA表达较正常组显著升高，补充外源性L-Arg后，AR mRNA的表达降到正常组水平，同时坐骨神经组织nNOS mRNA的表达及NOS、Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性和NO含量均显著升高，提示L-Arg可明显增加糖尿病大鼠坐骨神经组织NO的合成，使坐骨神经的血供得以改善；同时抑制AR 基因的表达，抑制多元醇代谢途径，对糖尿病大鼠坐骨神经损伤有一定的保护作用。

    ET-1和CGRP是一对作用相互对立的血管活性肽，ET-1是迄今所知体内作用最强的缩血管物质[8]，而CGRP作为一种神经肽广泛分布于神经系统中，是目前已知体内作用最强的舒血管多肽，具有拮抗ET-1生物效应的作用[9]。ET-1与CGRP的相对平衡维持着血管壁的张力，保证神经组织的血液供应。糖尿病时血管内皮损伤，NO合成减少，ET-1分泌增多，血管舒张功能受损，神经组织局部血流灌注不足，造成神经组织缺血缺氧，使CGRP释放减少。而CGRP的减少使其对血管的舒张作用减弱，而且对ET-1的抑制作用也削弱，这样有可能又加重神经组织的缺血缺氧，促使糖尿病神经病变的发生发展。本实验结果显示，糖尿病组大鼠血浆ET-1含量明显高于正常组，而NO、CGRP水平显著降低；予以补充外源性L-Arg后，血浆ET-1含量明显降低，而NO、CGRP含量明显升高，提示L-Arg能在一定程度上维持糖尿病大鼠ET-1/NO、ET-1/CGRP之间的动态平衡，对维持神经内膜血管张力，改善血供，预防糖尿病神经病变具有一定的作用。

    L-Arg是一种多功能氨基酸，具有调节机体免疫功能、促进伤口愈合、调节血管张力、保护血管内皮功能等作用[10]。本实验结果初步表明，L-Arg可通过改善糖尿病大鼠坐骨神经组织血液灌注，并拮抗其多元醇代谢途径的增强，对糖尿病大鼠坐骨神经损伤有一定的保护作用，其确切机制有待进一步研究。

【】
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