感觉神经端侧缝合后神经再生趋化性的实验研究

【摘要】  目的: 探讨感觉神经端侧缝合后神经再生的趋化性问题。方法: 健康雌性SD大鼠20只，分为神经端侧缝合组和正常对照组，每组10只。端侧缝合组切断前臂内侧皮神经，尺神经后内侧方外膜开窗，将前臂内侧皮神经和开窗的尺神经外膜做端侧缝合，正常对照组仅显露前臂内侧皮神经和尺神经。1年后采用乙酰胆碱酯酶染色和Fluoro-Gold荧光逆行示踪技术，观察和计数前臂内侧皮神经纤维和大鼠脊髓C5～T1前角和背根神经节神经元。结果: 乙酰胆碱酯酶染色结果显示，正常组未发现运动神经纤维，端侧缝合组有髓神经纤维数目是正常对照组的23.0％（P <0.01），运动神经纤维占有髓神经纤维的比例为0.34±0.16（P <0.01）。神经元逆行荧光示踪结果显示，正常组脊髓前角未发现荧光标记阳性的神经元；端侧组脊髓前角荧光标记神经元数目为150.9±104.8（P <0.01），运动神经元比例为0.27±0.11（P <0.01）。结论: 感觉神经端侧缝合后神经侧方出芽对特定靶器官的趋化性不明显。

【关键词】  周围神经；端侧缝合；趋化性

    Abstract:  Objective: To detect whether there is neurotropism following end-to-side neurorrhaphy of sensory nerve. Methods: Twenty female Sprague-Dawley rats were divided into 2 groups: end-to-side neurorrhaphy group and normal control group. In the end-to-side group， the cutaneous antebrachii medialis nerve(CAM) was transected， then an 1 mm epineural window was created on the ulnar nerve. Distal end of CAM nerve was sutured to the windowed ulnar nerve by means of end-to-side neurorrhaphy. In the normal control group， CAM and ulnar nerves were exposed. One year post-operatively，evaluations including acetylcholinesterase（AchE）stain and retrograde Fluoro-Gold neuron tracing were conducted. Results: AchE staining showed that in the end-to-side group myelinated nerve fiber count was 23.0% as compared to normal control group (P <0.01)， and the percentage of motor fibers in the end-to-side group was 0.34±0.16 (P <0.01). Retrograde neuron tracing demonstrated that the motor neuron counts in CAM end-to-side group were 150.9±104.8 (P <0.01)， and the percentage of motor neuron in the end-to-side group was 0.27±0.11 (P <0.01). Conclusion: Neurotropism in collateral spouting after end-to-side neurorrhaphy of sensory nerve is not significant.

    Key words:  peripheral nerve；end-to-side neurorrhaphy；tropism

    周围神经损伤是临床常见而恢复效果较差的损伤[1]。周围神经端侧缝合是将断离的周围神经的远侧断端，缝接在附近完整神经干的侧面。1992年巴西学者Viterbo[2]首次通过动物实验证实端侧缝合后受体神经存在新生神经纤维。之后各国学者进行了大量的相关研究，但是对于端侧缝合后的神经趋化性问题，研究较少。我们曾对混合神经端侧缝合后的趋化性问题进行研究，初步证实混合神经端侧缝合后神经再生对特定靶器官的趋化性不明显[3]，现选用纯感觉神经作为受体神经进一步研究该问题。

    1   材料和方法

    1.1  材料  成年雌性清洁级SD大鼠20只，体重100～150 g，实验动物手术和饲养均在复旦大学实验动物部进行（SPF级实验室）。SXP-1B台式手术显微镜（上海医用光学仪器厂产品）。LeicaDWLB2型荧光显微镜（德国Leica公司产品）。3% Fluoro-Gold水溶液(美国Sigma公司产品)。

    1.2  动物模型制备与分组  取SD大鼠，用1%戊巴比妥钠（5 mg/100 g）腹腔麻醉后，随机分成2组：①神经端侧缝合组。共10只，显露臂丛神经束支部。在前臂内侧皮神经发出点处将其切断，近侧断端用11-0线缝扎，逆向包埋入附近肌肉中。游离尺神经，在距其内侧束发出点5 mm处，用显微镊小心纵向撕开尺神经后内侧方长约1 mm外膜，注意避免损伤尺神经的神经束。然后用11-0线将前臂内侧皮神经远侧断端1针端侧缝合于尺神经后内侧方。②正常对照组。同前方法显露前臂内侧皮神经、尺神经，未予特殊处理。各组操作完毕，用生理盐水冲洗神经和创面后，逐层缝合胸大肌、皮肤。动物按组别分笼饲养。

    1.3  乙酰胆碱酯酶染色  动物饲养1年后，麻醉固定，显露臂丛神经束支部，正常组距发出点5 mm，端侧组距缝合点远端5 mm处取前臂内侧皮神经，均长约3 mm。经固定漂洗，冷冻切片，采用改良Karnovsky-Roots法孵育，采用VIDSⅢ型半自动图像分析仪进行图像分析，计数运动纤维含量。

    1.4  神经元荧光逆向示踪标记  动物饲养1年后，常规麻醉、固定后，显露前臂内侧皮神经。放大10倍显微镜下用1μl微量注射器于神经外膜下注射1μl 3% Fluoro-Gold水溶液。FG荧光染色3 d后，动物常规麻醉、固定后，经心脏灌注，切取C5～T1节段脊髓及背根神经节，再经固定脱水后，脊髓做横截面连续冰冻切片（Leica 冰冻切片机，德国），片厚50μm，背根神经节予以横断面连续切片，片厚40μm，用LeicaDWLB2型荧光显微镜观察，荧光滤镜采用2（激发波长330～380 nm），神经元胞浆内的Fluoro-Gold激发黄白色荧光（波长440 nm）。对各组的有核前角运动神经元及有核背根感觉神经元进行计数。

    1.5  统计学处理方法  实验数据采用Stata7.0统计分析软件进行统计学处理，设定可信水平为95%。资料分组正态分布时，选用成组t检验。资料分组呈偏态分布时，则用中位数(25%百分位数～75%百分位数)表示，选用非参数统计方法中的秩和检验。

    2  结果

    2．1  乙酰胆碱酯酶染色结果  正常对照组可见轴突不着色的有髓神经纤维（感觉神经纤维）和酶染强阳性的交感神经纤维，没有发现运动神经纤维。端侧缝合组有髓神经纤维数目是正常对照组的23.0%（P <0.01），其中轴突酶染阳性的运动神经纤维，占有髓神经纤维的比例为0.34±0.16（P <0.01）（见表1，图1）。

    2.2  神经元逆行荧光示踪结果  正常组脊髓前角未发现荧光标记阳性的神经元；端侧组脊髓前角荧光标记神经元数目为150.9±104.8，运动神经元比例为0.27±0.11（P <0.01）。端侧组背根神经节荧光标记神经元数目占正常组的27.6%（P <0.01）（见表2，图2）。

    3  讨论

    目前众多学者证实神经端侧缝合后存在再生神经[4，5]，本实验中，我们将前臂内侧皮神经与尺神经端侧缝合，1年后检测再生神经纤维和脊髓神经元，发现再生的神经纤维数目占正常对照组的23%，再生的神经元数目占正常对照组的39%，进一步证实端侧缝合在促进神经再生方面的有效性。

    神经趋化性（neurotropism）是指神经再生的轴突能够识别远端神经的性质，并朝相应的靶器官生长，这种作用被认为是由靶器官产生的诱导性蛋白成分所致，此理论由Forssman于1898年最先提出。目前一般认为周围神经终端出芽再生是具有趋化性的。一般分为以下三个层次：组织特异性、解剖特异性或神经束特异性和终末器官特异性。

    而对于周围神经侧方出芽，再生神经是否有趋化性，相关的研究较少。Al-Qattan等[6]曾用硅管与外膜开窗的坐骨神经端侧缝合，50 d后取硅管内组织检测，没有发现新生神经纤维。作者认为是由于硅管内不含有变性雪旺细胞，所以不能诱发侧方出芽,初步证实周围神经侧方出芽具有组织特异性。我们曾对混合神经应用乙酰胆碱酯酶染色技术初步证实周围神经端侧缝合后再生神经终末器官的特异性不明显[3]。本实验在此基础上选用感觉神经作为受体神经进一步研究端侧缝合后趋化性问题。本实验中，正常组大鼠前臂内侧皮神经乙酰胆碱酯酶染色未发现酶染阳性的有髓神经纤维，荧光示踪脊髓前角也没发现阳性神经元，证实大鼠前臂内侧皮神经为感觉神经。我们将前臂内侧皮神经与尺神经上臂段端侧缝合，由于此处尺神经为混合神经分布的特点[3]，如果再生神经对特定靶器官的趋化性明显时，再生的神经将呈现感觉神经分布的特点，反之，当趋化性不明显时，再生的神经将呈现与供体尺神经相类似的特点，即混合神经分布的特点。

    实验结果显示，再生的前臂内侧皮神经内可以观察到酶染阳性的有髓神经纤维即运动神经纤维，占有髓神经纤维的比例为0.34±0.16(P <0.01)，脊髓前角荧光标记阳性的神经元即运动神经元占所有阳性神经元比例为0.27±0.11(P <0.01)。这说明周围神经侧方出芽时，受体神经虽然是感觉神经，但再生的神经纤维呈现混合神经的特点，与供体神经尺神经的神经分布特点相一致，也就是说感觉受体神经并未只诱导出感觉神经，再生的神经性质由供体神经性质决定，证实了端侧缝合后神经再生的神经纤维对特定靶器官的选择性不明显。

【】
  [1] 李志杰,高伟阳,廖孔荣,等.医源性周围神经损伤及显微外科[J].温州医学院学报,2002,32(2):115-116.

[2] Viterbo F,Trindade JC,Hoshino K,et al.Latero-terminalneurorrhaphy without removal of the epineural sheath. Experimental study in rats[J]. Rev Paul Med,1992,110(6):267-275.

[3] 虞庆,王涛,罗鹏波，等.周围神经端侧缝合后神经再生及其趋化性的实验研究[J].中华手外科杂志，2007，23(1): 30-33.

[4] Oswald TM,Zhang F,Lei MP,et al. Muscle flap mass preserva-tion with end-to-side neurorrhaphy: an experimental study[J].J Reconstr Microsurg,2004,20(6):483-488.

[5] De Sa JM,Mazzer N,Barbieri CH,et al. The end-to-side peripheral nerve repair. Functional and morphometric study usingthe peroneal nerve of rats[J]. J Neurosci Methods,2004,136(1):45-53.

[6] Al-Qattan MM,al-Thunyan A.Variables affecting axonal re-generation following end-to-side neurorrhaphy[J]. Br J PlastSurg,1998,51(3):238-242.