温病湿热证大鼠模型肝线粒体K+-Na+-ATP酶活力变化的对比研究
作者：程方平 刘松林 李云海 周璇 梅国强
【摘要】 ［目的］探讨多因素复合造模方法对模型大鼠能量代谢的影响。［方法］分为正常组、湿热模型组（高脂+高温高湿+大肠杆菌）、模型对照组（普食+高温高湿+大肠杆菌）；运用定磷法测肝线粒体Na+-K+-ATPase活性。［结果］模型组与模型对照组肝线粒体Na+-K+-ATPase活性均较正常组显著降低，但两者比较无显著性差异。［结论］肝线粒体Na+-K+-ATPase活性显著降低，是湿热证模型的病理基础之一，与是否高脂饮食无关。
【关键词】 温病；肝；线粒体；酶活力；K+-Na+-ATP；湿热证；大鼠
Abstract:［Objective］To explore the effects of the model establishment methods on energy metabolism indicators of model rats.［Methods］ Set up normal group,model group(high fat diet + high temperature and high humidity + colon bacillus)，contrary group (routine diet + high temperature and high humidity + colon bacillus)，the activity of liver mitochondria Na+-K+-ATPase was detected by principle of determines the content of phosphorus.［Results］ The Na+-K+-ATPase active inmodel group was remarkably decreased，and had no significantly difference from contrary group.［Conclusion］The liver mitochondria Na+-K+-ATPase being remarkably decreased is one of pathological basis of damp-heat model，un-related with high fat diet.
Key words:febrile disease;liver；mitochondria；enzyme activity;K+-Na+-ATP;damp-heat syndrome；rat
湿热既是中医特有的致病原因，又是具有广泛临床基础的中医病证，涉及多系统、多器官、多组织的病变。为了进一步揭示湿热证的本质，我们模拟湿热发病原因，观察环境、生物因素对模型大鼠肝线粒体Na+-K+-ATPase活性的影响。
1 实验材料
1.1 实验动物
清洁级wistar大鼠，雌雄各半，体重200g±10g。由湖北省医学实验动物中心提供。
1.2 药物及试剂
(1）大肠杆菌：菌种号：AB94013。武汉大学微生物保藏中心提供。湖北中医学院微生物室复壮、培养，应用浓度为109/ml，4℃冰箱保存。（2）高脂饲料：胆固醇、胆酸钠，武汉亚法生物技术有限公司提供。配方：普通饲料+胆固醇25g/kg+胆酸钠2g/kg+蛋黄粉80g/kg+猪脂100g/kg。（3）ATP酶测试盒：南京建成生物工程研究所。
1.3 实验仪器
人工气候箱SHH-500GS型，重庆市永生实验仪器厂，体温计上海医用仪器厂，台式低温高速离心机TGL-16G-A，上海安亭仪器厂，721分光光度计16C14型，上海精密科学仪器有限公司。
2 实验方法
2.1 动物分组
常规喂养3d，随机将24只大鼠分为：正常组、湿热模型组（高脂+高温高湿+大肠杆菌）、模型对照组（普食+高温高湿+大肠杆菌）。
2.2 造模方法
正常组：在正常温湿度（温度24～28℃，相对湿度60%～75%）环境下，普通混合饲料喂养29d。湿热模型组：在正常温湿度环境下，高脂饲料喂养2周后，再放入人工气候箱中（温度35℃，相对湿度95%），每天造模时间（上午8～12时，下午13～17时），高脂饲料喂养。12d后，灌服大肠杆菌109/ml·200g-1（预实验摸索剂量）。4h后，再加强灌服1次，继续放入人工气候箱造模观察3d。模型对照组：过程同湿热模型组，整个过程普食喂养。
2.3 标本采集
分别于湿热模型组、模型对照组灌服大肠杆菌（浓度109ml·200g）后72h，脱椎处死大鼠。迅速剖腹取各组肝组织置于4℃生理盐水中，洗去表面的残血，滤纸吸干，取大鼠肝脏6g，放入盛有10%福尔马林的容器中，存-20℃冰箱中。取肝组织1g，剪碎，按重量体积比，加入分离介质（内含蔗糖0.3mol/L，HEPES5mmol/L，EDTA0.5mmol/L，PH7.4）制备成10%的组织匀浆，随后以3000rpm离心10min，然后取组织匀浆上清液，再用分离介质按1：9稀释成1%组织匀浆。待测。
2.4 肝线粒体K+-Na+-ATP酶活性测定
按照Na+-K+-ATPase试剂盒说明书操作。ATP酶活力单位以每小时分解组织蛋白（mg prot）产生无机磷（pi）的含量来表示：即μmol·pi/mg pr·h-1。
2.5 统计学分析
用spss13.0统计软件统计处理，数据均以均数加减标准差表示，采用单因素方差分析，组间用q检验。P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有非常显著性差异。
3 实验结果
3.1 症状体征
湿热模型组：在灌服大肠杆菌前，饮水量、饮食量已有所减少，少数大便较软，存在少许粘液。尿黄浊，灌服大肠杆菌后，全部大鼠体温升高，3d后仍不退。这些症状加重，大便次数增多，有些呈稀烂状。全部大鼠蜷卧懒动，耸毛明显，毛色暗黄无泽，与正常组比较普遍消瘦。模型对照组：体温同湿热模型组，维持时间稍短，饮水、饮食量较正常组少，大便有些变软。余与湿热模型组相同。正常组动物：在喂养四周期间，以上指征均无明显变化。
3.2 肝线粒体Na+-K+-ATPase水平变化
湿热模型组、模型对照组肝线粒体Na+-K+-ATPase活性均较正常组非常显著降低（P<0.01），湿热模型组与模型对照组比较无显著性差异（P>0.05）。见表1。表1 各组大鼠肝线粒体Na+-K+-ATPase水平比较（略)
4 讨论
肝脏是能量代谢的重要器官，含有丰富的线粒体，而线粒体是细胞有氧呼吸的基地和能量供应的场所，是细胞中重要的细胞器，细胞生命活动约95%的能量来自线粒体。Na+-K+-ATPase作为穿膜离子传递体系的一部分，分解ATP产生能量，建立细胞内外离子梯度，从而保持细胞、组织膜内外电势差和渗透压平衡，进而维持细胞、组织内外钠水平衡。而其作用的发挥很大程度上依赖于ATP即能量的产生，若供能不足，“泵”功能的失调，将打破钠、钾的动态平衡状态，导致细胞组织内Na+增多，K+减少，从而造成水液平衡失调，致细胞、组织（线粒体）水肿，而细胞、组织等结构发生改变，从而导致进一步供能不足。表明湿热证红细胞模Na+-K+-ATPase的活性显著降低［1-2］，电镜下发现肝脏线粒体肿胀，嵴短缺甚至消失，有的完全呈空泡化［3］。有人认为，自由基造成Na+-K+-ATPase活性部位某些最基本氨基酸的氧化，引起酶的活性降低。也有文献报道是由于自由基致使胞膜产生的脂质过氧化产物（如丙二醛MDA）影响酶蛋白的分子结构，继发影响酶的活性［4］，从而使Na+-K+-ATPase活性降低。
本实验研究表明，不论是否高脂饮食，模型动物均出现肝线粒体Na+-K+-ATPase活力下降，是湿热证模型的病理基础之一。K+-Na+-ATPase的极显著降低，打破Na+、K+的动态平衡，致细胞组织水肿，使细胞组织结构发生改变，从而进一步导致功能不足，产生恶性循环。这些病理生理效应，可较好地解释湿热证的所见身重肢倦、口渴、不欲饮水等湿性粘滞、重着现象。
【文献】
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［3］张六通.外湿大鼠关节、肺、大小肠和肝病研究［J］.中医基础医学杂志,1996,6(3):35-37.
［4］郭遂群.老年NIDDDM病患者氧化损伤、抗氧化能力和血糖控制［J］.国外医学临床生物学与检验学分册,1999,20(2)：88.
