α?黑素细胞刺激素在不同实验动物表皮中的表达及意义

【摘要】  ［目的］初步研究α?黑素细胞刺激素（α?melanocyte?stimulating hormone，α?MSH）在不同实验动物表皮中的表达并阐明其意义，为色素障碍性皮肤病动物实验提供新的理论依据。［方法］对4组不同正常实验动物的表皮标本进行组织切片，应用免疫组织化学技术，观察α?MSH在4组不同实验动物表皮中的表达。［结果］α?MSH在白色昆明小鼠毛囊及白色FMN豚鼠表皮中呈阴性表达，在C57BL/6J小黑鼠毛囊黑素细胞及棕黄色HARTLY豚鼠表皮黑素细胞中呈阳性表达。［结论］白色昆明小鼠及白色FMN豚鼠适宜做色素增加动物实验研究，C57BL/6J小黑鼠及棕黄色HARTLY豚鼠适宜做色素减退动物实验研究；α?MSH可做为观测色素代谢障碍性疾病动物实验研究的一个重要指标。

【关键词】  α?黑素细胞刺激素；色素；表皮；动物实验

　　Abstract： ［Objective］To observe the expression of α?MSH in four different animals’scarfskin and to study its meaning for finding a novel evidence to research zoopery of pigment disease.［Methods］Scarfskins sheared from four different animal’s skin were made into specimens,and then treated with α?MSH under the technique of immunohistochemical staining.［Results］There were negative expressions of α?MSH in both the hair follicle melanocytes of the Kunming white?mouse and the scarfskin of the FMN white?guinea pig;while there was positive expression in both the hair follicle melanocytes of the C57BL/6J black?mouse and the scarfskin of the HARTLY brown yellow?guinea pig.［Conclusion］The two white?skin animals are suit for research of zoopery of increased?pigment disease,while the other two are suit for research of zoopery of reduced?pigment disease;and α?MSH is one of the most important indicators in the research of zoopery with pigment disease.

　　Key words: α?MSH；pigment；scarfskin；zoopery
   
　　色素代谢障碍性皮肤病是皮肤科一类常见疾病，由于发病机理不详，故尚缺乏有效手段。目前研究表明，表皮黑素细胞、角朊细胞可因多种因素刺激通过自分泌和旁分泌机制产生α?MSH，α?MSH通过与黑素细胞表面黑皮素－1受体结合而激活环磷酸腺酐/蛋白激酶A 途径，使黑素细胞黑素合成及分泌增加［1］。我们拟采用免疫组织化学技术，对α?MSH在4种常用于研究色素代谢障碍性皮肤疾病的动物［2］表皮中的表达进行观察，并判定其意义，以便为该病的动物实验研究提供新的理论依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验材料

　　1.1.1  实验动物  SPF级雌性昆明种小白鼠12只、C57BL/6J小黑鼠12只(由南方医科大学实验动物中心提供)，体重均为22g±3g，12周龄。雌性白色FMN豚鼠、雌雄各半的棕黄色HARTLY豚鼠各12只(由南方医科大学实验动物中心提供)，体重均为300g±20g。

　　1.1.2  实验试剂  Sheep Anti?α?MSH polyclonal antibody（CHEMICON）；Rabbit Anti?SheepIgG（H＋L）（SouthernBiotech）；DAB显色试剂盒（北京博奥森生物技术公司）；抗体稀释液（北京中山生物技术有限公司）；10%中性甲醛及多聚赖氨酸（北京赛驰生物科技有限公司）；PBS、柠檬酸盐缓冲液（武汉博士生物技术有限公司）。

　　1.1.3  实验仪器  RM2135型石蜡切片机(LEICA)；XSP?12C型OLYMPUS显微镜(上海长方光学仪器有限公司)；HS恒温恒湿箱(无锡索南亚试验设备有限公司)；可调微量移液仪、湿盒、切片架(北京金辉盛业科技有限公司)。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  动物处理  小白鼠、小黑鼠各12只；雌雄各半的棕黄色豚鼠、雌性白色豚鼠各12只，各组动物预养3d，正常喂养1周后，于第8天上午将各组动物用3%戊巴比妥45mg/Kg腹腔麻醉后，作常规固定，刮除背部皮肤表面毛发，用组织剪剪取2cm×2cm大小皮肤数块，10%中性甲醛固定，常规石蜡切片备用。

　　1.2.2  免疫组织化学检测  链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(S-P)常规染色法：石蜡标本常规4um连续切片。石蜡切片脱蜡，水中展开；PBS缓冲液冲洗3min×3次；3%H2O2阻断内源性过氧化物酶室温10min；PBS缓冲液冲洗2min×3次；枸橼酸盐缓冲液煮沸抗原修复；PBS缓冲液冲洗2min×3次；滴加10%正常山羊血清封闭液室温孵育10min后倾去血清；滴加稀释好的Sheep Anti?α?MSH polyclonal antibody湿盒内室温孵育60 min；PBS缓冲液冲洗2min×3次；滴加Rabbit Anti?Sheep IgG（H＋L）室温孵育10min；PBS缓冲液冲洗2min×3次；滴加HRP标记链亲和素室温孵育10min；PBS缓冲液洗2min×3次；滴加棕色DAB 显色液（现配现用）镜下掌握显色程度；蒸馏水充分冲洗；苏木素轻度复染2～3 min；自来水冲洗5～15min；盐酸酒精分化8s；上行酒精脱水、透明；中性树胶封片。用缓冲液替代第一抗体做阴性对照。用已知阳性切片作为阳性对照。

　　1.2.3  显微镜观察  200倍下随机选择20个视野观察表皮黑素细胞α?MSH阳性细胞，并由JVC彩色摄像头将细胞图像输入Mias系统拍照。

　　1.2.4  结果判定  α?MSH定位于黑素细胞胞浆和细胞外基质［3］，以显微镜下黑素细胞胞浆或细胞外基质出现棕黄色颗粒状或团块状者为阳性表达。采用二级记分法判断结果，根据20个视野下阳性细胞数占总细胞数的比例分为4级：小于10%为0分；11%～40%为1分；41%～70%为2分；大于71%为3分。根据着色深浅分4级:浅黄色为0分，黄色为1分；棕黄色为2分；深棕色为3分。以上两种分级相加小于2分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性(++)，6分为强阳性(+++)。

　　2  结果
   
　　α?MSH的表达定位于小鼠毛囊黑素细胞及豚鼠表皮黑素细胞的胞浆或细胞外基质，为黄或棕黄色颗粒，呈局灶性或弥漫性分布。结果显示，α?MSH在白色昆明小鼠毛囊及白色FMN豚鼠表皮中均呈阴性表达，在C57BL/6J小黑鼠毛囊黑素细胞及棕黄色HARTLY豚鼠表皮黑素细胞中均可见阳性表达，镜下在细胞浆成颗粒状或团快状（图1、图2）。α?MSH测定结果如表1所示。

　　图1  α?MSH在小黑鼠毛囊黑素细胞中阳性表达（IHC×200）（略）

　　图2  α?MSH在棕黄色豚鼠表皮黑素细胞中阳性表达（IHC×200）（略）

　　表1  α?MSH在小黑鼠毛囊黑素细胞及棕黄色豚鼠表皮黑素细胞中表达率的比较（略）

　　3  讨论
   
　　色素代谢障碍性疾病主要是皮肤黑素代谢障碍引起的,但目前国内外对该病的研究多固定于酪氨酸酶表达水平的检测，大多数动物实验也以此为指标，缺乏较深层次的研究指标。事实上黑素细胞的黑素生成是一复杂的过程,有多种因素参与调节。早在20世纪80年代有人发现在皮肤中存在α?MSH［4］，并且α?MSH对鼠毛囊黑素细胞及表皮黑素细胞的调控作用随之证实；Matsumoto［5］等观察到人体皮片移植到裸鼠身上后，在创面愈合过程中其表皮可检测到α?MSH有很强的表达；Dorr［6］等也报道给自愿者注射合成的强效黑皮素激素［Nle4?D?Phe7］?α?MSH，与对照组比较自愿者面部及前臂皮肤色素沉着明显加深，且优黑素合成比率增加；Tsatmali［7］等亦报道了外周皮肤中存在的α?MSH与皮肤色素沉着有关；最近有研究证实，表皮细胞中黑素细胞能产生和分解阿黑皮素原，生成α?黑素细胞刺激素等黑皮素，再与黑皮素－1受体结合，激活腺甘酸环化酶，提高细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平，进而激活cAMP倚赖蛋白激酶，促进酪氨酸酶的合成及表达，促进黑素细胞有丝分裂，使黑素细胞快速增值，促进黑速合成［8］。因此α?MSH在色素代谢过程中具有重要的调控作用。
   
　　上述实验中的四种动物目前广泛应用于色素代谢障碍性皮肤疾病的动物实验研究中，或是建造动物模型，或是用于相关病理、药理等的研究，报道颇多，但却缺乏相应的理论依据及说明。而笔者通过免疫组化方法，证实了α?MSH在白色昆明小鼠毛囊及白色FMN豚鼠表皮中呈阴性表达，在C57BL/6J小黑鼠毛囊黑素细胞及棕黄色HARTLY豚鼠表皮黑素细胞中呈阳性表达，且主要分布在细胞浆中。因此以上实验提示我们，以两种小鼠而论，因α?MSH仅在其毛囊黑素细胞中可呈阳性表达，故适宜用于仅观测毛囊黑素及α?MSH变化情况的实验研究，而且白色昆明小鼠适宜做皮肤色素增加类型的动物实验，C57BL/6J小黑鼠适宜做皮肤色素减退类型实验；以两种豚鼠而论，因α?MSH在毛囊黑素细胞及表皮黑素细胞中均可呈阳性表达，且与人体皮肤较为接近，故适宜用做观察皮肤整体黑素及α?MSH变化情况的实验研究，而且白色FMN豚鼠适宜做皮肤色素增加类型的动物实验，棕黄色HARTLY豚鼠适宜做色素减退型实验。并以此为色素代谢障碍性皮肤疾病动物实验中动物的选择提供一定的理论依据。同时，本研究结果表明，α?MSH在4种不同种属的正常动物表皮中呈现不同程度的表达，提示我们α?MSH可作为一个较酪氨酸酶更为深入的指标，用来观测及研究动物表皮色素代谢变化，但其具体的作用机制尚有待进一步探讨。
   
　　总之，随着动物实验研究的进步以及对α?MSH调控黑素合成作用的更进一步了解，必将为解决临床上获得性色素沉着或色素脱失性疾病提供一种新的方法。

【文献】
  　　［1］ 李海洋，赵文清，郑信民.自体全厚皮片内角朊细胞组织学改变对移植物过度色素沉着的影响［J］.修复重建外科杂志，1997，11（2）：72?75.

　　［2］ 过伟峰.建立小鼠黄褐斑实验动物模型的初步研究［J］.中国中医基础医学杂志，2001，7（2）：49?51.

　　［3］ Slominski A，Wortsman J，Luger T，et al.Corticotropin releasing hormone and proopiome lanocortin involvement in the cutaneous response to stress［J］.Physiol Rev，2000，80(3):979?981.

　　［4］ Thody AJ，Ridley K，Penny RJ,et al.MSH peptides are present in mammalian skin［J］.Peptides,1983,4(6):813.

　　［5］ Matsumoto K，Robb E，Warden G,et al.Hyperpigmentation of human skin grafted on to athymic mice: immunohistochemical study［J］.Br J Dermatol,1996,135(3):412?418.

　　［6］ Dorr RT，2Dvorakova K，Brooks C,et al.Increased eumelan in expression and tanning is induced by a superpotent melanotrop in ［Nle4?D?Phe7］?α?MSH in humans［J］.Photochem Photobiol,2000,72(4): 526?532.

　　［7］ TsatmaliM，Ancans J，Thody AJ.Melanocyte function and its control by melanocortin peptides［J］.Histochem Cytochem，2002，50(2): 125?133.

　　［8］ Abdel?Malek ZA,Scott MC,Furumura M,et al.The melanocortin 1 receptor is the principal mediator of the effects of agoutin signaling protein on mammalian melanocytes［J］.Cell Sci,2001,114(Pt 5):1019?1024.