血清γ?球蛋白的分离、纯化与鉴定的综合实验建立与探讨
【关键词】 综合实验 生物化学 γ?球蛋白
生物化学是研究生物体内化学分子与化学反应的，从分子水平探讨生命现象的本质［1］。生物化学基本理论的建立、完善和是以实验研究为基础［2］。而要完成开发学生的潜能，培养学生的创新精神和创新能力，培养大学生的综合素质这一任务的重要手段是在开设的综合实验中得以实现的［3］。我们依据最新教学大纲，结合实验室现有的条件，对原有实验内容进行了重新整合，力争即有保留又有创新，设计了规模较大的综合实验“血清γ?球蛋白的分离、纯化与鉴定”。经过反复实验预试，并经过一年（两学期）医学本科学生的实验教学证明，实验方法稳定，结果重复可靠，便于学生操作，教学效果良好。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
1.1.1 仪器 KDC?40低速离心机、1.5cm×20cm玻璃层析柱、722?可见分光光度计、DYY?2C电泳仪及DYCZ?24D型垂直板电泳槽均为国产。
1.1.2 试剂材料 新鲜猪血清、pH7.0饱和硫酸铵溶液、0.01mol/L pH7.0 PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）、葡聚糖凝胶G?25（SephadexG?25）、奈氏（Nessler）试剂、20%（W/V）磺基水杨酸溶液、pH8.6离子强度0.06巴比妥缓冲液、氨基黑10B、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS（十二烷基硫酸钠）考马斯亮蓝R?250、甘氨酸、Tris、BSA（牛血清白蛋白）等除SephadexG?25(SWEDEN进口分装)外均为国产。
1.2 方法 取新鲜血清2ml，加入等量PBS和饱和硫酸铵溶液，混匀后静止30min，3 000 rpm离心10min，沉淀物即是γ?球蛋白。该步骤可重复1?2次，以保证纯度。
将γ?球蛋白通过SephadexG?25层析作用，用PBS洗脱，除去蛋白质中的小分子铵盐，从而达到γ?球蛋白纯化的目的。洗脱下来的收集液可以用磺基水杨酸检测蛋白质的存在，用奈氏试剂检测是否除净NH4+,然后把含有γ?球蛋白的样品合并收集。
把纯化的γ?球蛋白与正常猪血清样品进行醋酸纤维素膜电泳作对照验证。
把纯化的γ?球蛋白、正常猪血清样品用双缩脉试剂显色后，用分光光度法测定其含量，并稀释成2mg/ml。
把纯化的γ?球蛋白、正常猪血清及标准蛋白（2mg/ml）分别用含巯基乙醇的样品缓冲液处理，用12%分离胶进行SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS?PAGE)［4］，作进一步对照验证。
2 结果
2.1 醋酸纤维素膜电泳 纯化的γ?球蛋白样品为一条带（γ?球蛋白位置）；正常猪血清样品为五条带（清蛋白、α1、α2、β及γ?球蛋白）
2.2 SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳 正常猪血清样品出现十几条带，在清蛋白前面出现二条带且与纯化的γ?球蛋白样品出现的二条带相平行。标准蛋白为纯一条带且与正常猪血清样品的清蛋白相平行，而纯化的γ?球蛋白样品无明显清蛋白，其它蛋白带与正常猪血清样品相比较颜色对应变浅。
3 讨论
3.1 目的原理 血清中的γ?球蛋白是一类结构相似具有重要免疫功能的多种蛋白质，它们的分子量多数在150KDa左右，基本结构由两条分子量相同的轻链(Ｈ链23KDa)和两条分子量相同的重链(Ｌ链55KDa)通过二硫键连接组成。
分离、纯化与鉴定γ?球蛋白的方法很多，从设计的生化实验目的考虑，选用硫酸铵盐析分离、葡聚糖凝胶纯化γ?球蛋白，不仅保证其相对纯度，节省时间，更重要的是保证其完好的生物学活性。而用醋酸纤维素膜电泳和SDS?PAGE，对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定，是较为、快速且可重复的方法，尤其是SDS?PAGE，已成为许多研究领域广为应用的重要分析技术。
我们把纯化的γ?球蛋白、正常猪血清及标准蛋白用含有巯基乙醇的样品缓冲液处理后进行SDS?PAGE，可使纯化的γ?球蛋白、正常猪血清中的γ?球蛋白还原成两条分子量相同的轻链和两条分子量相同的重链而出现二条带，且相互平行；而标准蛋白不含二硫键，不能解链，故只出现一条带且与正常猪血清中的清蛋白相平行。至于纯化的γ?球蛋白样品除γ?球蛋白解链为重轻链后的其它蛋白在盐析时已分离出大部分，经高灵敏度的SDS?PAGE仍可不同层度的显现出浅带。
3.2 体会 实验样品来源为猪血清，取材方便易得，同时节约了样品的用量，本实验只需1份(每1个小组)2 ml血清样品即可满足所需；节省了实验经费的支出；对环境无污染；而标准蛋白采用单一成分为国产牛白蛋白（67KDa），价格低廉，而且电泳成带清晰整齐，尤其适合教学。
结构安排合理，难易适度，精简了教学时数。综合实验共用16学时，分二次完成。第一次8学时，血清γ?球蛋白的分离、纯化与鉴定（一），完成血清γ?球蛋白的分离、纯化及醋酸纤维素膜电泳；第二次8学时，血清γ?球蛋白的分离、纯化与鉴定（二），完成γ?球蛋白、正常猪血清样品的定量和SDS?PAGE,在时间上至少节省8学时。
在学生实验操作上，从刻度细管，可调玻璃加液器的使用到微量进样器，可调式移液器选用；从免疫抗体的分离、纯化到化学的显色和沉淀法的应用以及分子解链电泳，整个实验的基本理论清楚，有据可循，难易适度，循序渐进。
实验技术全面，方法稳定，使传统与结合。综合实验选用了生物化学较为代表，反映基本理论和基本技能又能培养学生科研能力的典型且便于操作的实验，并使之有机的整合为一体。整个实验覆盖了传统生化技术，包括离心技术、层析技术、分光光度法和电泳技术。并可以对二种电泳的方法、条件、应用范围及灵敏度等进行比较。
从学生实验结果看，在同等条件下，提取的γ?球蛋白和正常猪血清中的γ?球蛋白解链，其它蛋白和标准蛋白则不解链，从生理血清到分子蛋白；由样品的提取，到分子量的定位，特别是醋酸纤维素膜电泳的γ?球蛋白位于第五条带，经过巯基乙醇处理的SDS?PAGE后，使γ?球蛋白重轻链分离，却活生生的跑到比γ?球蛋白分子量小的清蛋白的前面，实验结果直观可见，可比性强，举一反三。
增加了知识的综合性，提高学生对实验的极大兴趣。血清γ?球蛋白的分离、纯化、鉴定、蛋白定量及进一步鉴定五个子实验作为一个综合实验，涉及化学、生物、分子生物、生理及免疫等相关学科知识，内容连惯，一环紧扣一环，哪一环节出了差错都不可能有理想的结果，同时增加了实验的相对难度和操作的复杂性。学生都渴望自已的实验有满意的结果，势必要求学生从第一步操作开始，到最后做出实验结果，一点都不能含糊，认真主动的做好每一步，去求证理论的依据，这样达到了锻炼学生动手能力的教学目的，理论与实践的有机结合。
实验可分可合，可适合多层次教学。随着不断和多层次多元化办学模式的出现，我们原有的一些生物化学实验已不能满足多层次教学的需要。改革后的综合性实验既适合于本科生教学，由16学时完成；也可以根据不同专业，为专科高职生开设，分几次完成（每次4学时），如γ?球蛋白分离与纯化（盐析与除盐）；醋酸纤维素膜电泳鉴定及用分光光度法测定血清蛋白含量。避免不必要的新开实验，减少实验准备材料，有利提高教学水平。
总之，综合实验将成为大学生综合素质培养、技术训练、对先进技术设备了解与掌握、创新人才孵育的摇篮［5］。
【】
［1］周爱儒,查锡良.生物化学［M］.第6版,北京：人民卫生出版社,2004.1.
［2］刘先俊.对医学生物化学的教学体会［J］.医学教育探索．2006，5(7):609-610.
［3］张卓.构建实验教学手段创新体系,培养新世纪高素质创新人才［J］.实验室研究与探索，2001，20(5):1-5.
［4］张龙翔,张廷芳,李令媛.生化实验方法和技术［M］.北京：人民教育出版社,1981.112-119.
［5］刘欣欣,杨廷桐,李秀杰.论综合实验的创新性教育［J］.医学教育探索，2006，5(3):218-222.
